鼓槌石斛毛蘭素誘導人結腸癌Caco-2細胞凋亡

崔名揚,康丹丹,和　磊,石玉潔,任建武,*

(1.北京林業大學生物科學技術學院,北京 100083;2.北京大學醫學部藥學院,北京 100191)

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鼓槌石斛毛蘭素誘導人結腸癌Caco-2細胞凋亡

崔名揚1,2,康丹丹1,和磊1,石玉潔2,任建武1,*

(1.北京林業大學生物科學技術學院,北京 100083;2.北京大學醫學部藥學院,北京 100191)

目的:研究毛蘭素對人結腸癌Caco-2細胞增殖的抑制作用及其誘導細胞凋亡的分子機制。方法:采用 SRB法檢測毛蘭素對 Caco-2細胞增殖的抑制作用,用 Hoechst33342染色法觀察細胞的形態學改變,流式細胞術檢測細胞的凋亡率和細胞周期;蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測細胞凋亡相關蛋白Caspase-3的表達水平。結果:與對照相比,毛蘭素能抑制結腸癌細胞Caco-2的增殖,且抑制率隨著藥物濃度與時間增加,呈劑量時間效應,48 h半數抑制濃度IC50為0.845 μg/mL;毛蘭素能誘導Caco-2細胞凋亡,并誘導細胞周期阻滯于G2期;Caspase-3活性裂解片段表達增高。結論:毛蘭素對腫瘤細胞的增殖具有一定抑制作用且通過線粒體途徑誘導Caco-2細胞凋亡。

毛蘭素,結腸癌細胞Caco-2,細胞凋亡,鼓槌石斛

結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)為人類高發惡性腫瘤,近20年來其發病率逐漸上升,對人類健康造成嚴重威脅[1]。結腸癌患者術后5年生存率較低且目前尚無治療結腸癌的特效藥,因此繼續尋找高效的抗癌藥物任重道遠[2-3]。眾多國內外學者嘗試從天然藥物中尋找能有效抑制癌細胞增殖,誘導其凋亡的藥物用于結腸癌的治療。

石斛屬(Dendrobium)是蘭科植物中一個較大的屬[4],在我國分布有74種和2變種[5]。石斛屬植物含多種化學成分,包括生物堿、酚類[6]、微量元素[7]等成分。其藥理作用廣泛,在抗腫瘤、提高人體免疫力等方面均有良好療效[8]。鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum Lindl)為蘭科石斛屬草本植物,產于我國西南部。毛蘭素是從鼓槌石斛中分離得到的活性化合物之一,研究表明此類化合物具有良好的抗腫瘤活性,崔旭琴[1]等人研究證實了其對結腸癌細胞SW-480的生長抑制作用,毛蘭素通過下調XIAP、Bcl-xL蛋白表達以及激活Caspase-9、7、3和PARP活性從而誘導SW480細胞凋亡。毛蘭素對HL-60腫瘤細胞的生長、分化亦具有明顯抑制作用,并且在鏡下觀察到細胞呈現凋亡形態學特征[9],毛蘭素能通過調節Akt激酶活性、下調Mcl-1蛋白表達的方式誘導肝癌細胞Huh7凋亡[10],亦有研究表明毛蘭素對胃癌細胞 SGC-7901生長分化具有明顯抑制作用[11]。在國外已經有實驗就毛蘭素和以毛蘭素為底物的衍生物ZJU-6的抗腫瘤效果進行比較[12],但毛蘭素對結腸癌Caco-2細胞增殖的作用尚未有報道,因此本文探討了鼓槌石斛毛蘭素對Caco-2細胞的生長抑制作用及凋亡誘導作用,為深入開展石斛抗腫瘤活性物質基礎及其分子機制研究提供參考,對于石斛屬資源的合理開發利用具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

Caco-2人結腸腺癌細胞由北京大學醫學部藥學院張強老師惠贈;毛蘭素純度大于99.99%,浙江天皇藥業有限公司;MEM培養液Gibco(C11095500BT);TCA(三氯醋酸)天津市永大化學試劑有限公司;SRB(磺酰羅丹明B)Sigma(1014409);JC-1、Hoechst 33342、Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒、RNA酶、PI(碘化丙啶)、Caspase-3活性檢測試劑盒、Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、Caspase-3、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)碧云天生物試劑公司;BCA試劑盒南京建成生物科技有限公司;硝酸纖維素膜(NC膜)武漢博士德生物工程有限公司。

CO2細胞培養箱日本三洋公司;IM200-FL倒置熒光顯微鏡北京冠普佳科技有限公司;Multiskan Mks型酶標儀、Multifuge 1L-R高速冷凍離心機美國Thermo electron有限公司;TD25-WS臺式多管低速離心機長沙平凡儀器儀表公司;DYY-7C電泳儀北京市六一儀器廠;轉膜儀美國伯樂公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養用含10%胎牛血清的MEM培養基(100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素)于37 ℃、5% CO2條件下進行細胞培養,0.25%胰蛋白酶消化,傳代。

1.2.2SRB法測定毛蘭素對細胞的抑制率接種4×103個對數期的Caco-2細胞于96孔細胞培養板上,鋪板24 h后分別加入不同濃度毛蘭素(0.01875、0.0375、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2 μg/mL)和1個空白組,3個時間點(24、48、72 h),至24、48、72 h藥物處理時間點后棄去培養液,每孔加入200 μL 4 ℃(10%)TCA(三氯醋酸)固定細胞,4 ℃,固定1 h;固定結束后用去離子水沖洗5次,室溫晾干,每孔加入100 μL SRB染液,染色30 min后棄去,用1%乙酸沖洗5次,室溫干燥,用100 μL非緩沖Tris-base堿液(10 mmol/L,pH=10.5)溶解未與細胞蛋白結合的染料,水平搖床上振蕩30 min,采用酶標儀在540 nm處測定其OD值并計算IC50,計算細胞抑制率:

抑制率(%)=((空白對照組OD值-實驗組OD值)/(空白對照組OD值))×100

1.2.3觀察細胞形態接種5×105個對數生長期的Caco-2細胞于12孔板中,鋪板24 h后,加入不同濃度的毛蘭素,設置0.6、1.2 μg/mL 2個濃度的毛蘭素加藥組和1個空白組,給藥48 h后棄去培養液,用PBS洗2次,顯微鏡下觀察,拍照(放大200倍)。

1.2.4共聚焦熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位接種5×105個對數生長期的Caco-2細胞于35 mm的共聚焦小皿上,鋪板24 h后,加入不同濃度的毛蘭素,設0.6、1.2 μg/mL 2個濃度和1個空白組,給藥48 h后棄去培養液,用PBS洗2次,每次2 min,然后加入冷的4%多聚甲醛1 mL,室溫固定15～20 min,之后用PBS洗2次,加入5 μg/mL的JC-1 37 ℃染色15 min,PBS洗2次,加500 μL PBS觀察拍照檢測。

1.2.5共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞核形態接種5×105個對數生長期的Caco-2細胞于35 mm的共聚焦小皿上,鋪板24 h后,加入不同濃度的毛蘭素,設0.6、1.2 μg/mL 2個濃度和1個空白組,給藥48 h后棄去培養液,用PBS洗2次,每次2 min,然后加入冷的4%多聚甲醛1 mL,室溫固定15～20 min,PBS洗兩次,加入2 μg/mL的Hoechst 33342染色30 min,37 ℃,染色后PBS洗2次,加500 μL PBS上機檢測。

1.2.6Annexin-V/PI法檢測細胞凋亡在6孔細胞培養板上接種5×105個對數生長期的Caco-2細胞,鋪板24 h后,分別加入不同濃度的毛蘭素,設0.15、0.3、0.6、1.2 μg/mL 4個濃度和1個空白組,48 h后收集細胞,將細胞培養液吸出棄去,用1×PBS洗滌一次,胰酶消解貼壁細胞,1000 r/min離心5 min,棄上清。用預冷的PBS重懸細胞2次,加入400 μL×Binding Buffer輕輕重懸細胞。加入5 μL的Annexin V-FITC輕輕混勻,室溫下避光孵育15 min。加入10 μL PI(碘化丙啶)染色液,混勻,避光染色5 min,1 h內上流式細胞儀檢測。

1.2.7流式細胞術測定細胞周期分布接種1×106個對數生長期的Caco-2細胞于6孔細胞培養板上,鋪板24 h后,加入不同濃度的毛蘭素,設0.15、0.3、0.6、1.2 μg/mL 4個濃度和1個空白組,48 h后收集細胞,經75%冰乙醇-20 ℃過夜固定后,用PBS洗滌2次,加入RNA酶,終濃度為100 μg/mL,37 ℃酶解30 min,移入流式管,然后加300 μL PI(含0.1%的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)),避光染色5 min,上機檢測毛蘭素對細胞周期分布的影響。

1.2.8Western Blot檢測毛蘭素對Caspase-3蛋白表達的影響采用PMSF裂解法提取藥物處理后的細胞總蛋白[13]。簡而言之,在50～80 μg總蛋白中加入適量4×SDS-PAGE上樣緩沖液,并于95 ℃條件下變性5 min,5%～15% SDS-PAGE電泳分離后轉移到NC膜上,經5%脫脂奶粉封閉后,用于抗Caspase-3一抗抗體孵育過夜以及辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的二抗抗體孵育,采用ECL法通過X-光片曝光顯影從而檢測Caspase-3蛋白表達,免疫印跡最后經洗滌后用β-actin作為內參確定蛋白上樣量。

1.2.9統計學分析結果以均數±標準差表示,SPSS 13.0統計分析軟件進行數據分析,p<0.05差異有顯著性意義,p<0.01差異有非常顯著性意義。

2　結果與分析

2. 1SRB法檢測毛蘭素對細胞抑制作用

圖1所示表明,藥物作用時間相同時,給藥24 h后,隨著毛蘭素濃度的增加,毛蘭素對Caco-2細胞的抑制率由6.67%上升至38.21%;給藥48 h后,抑制率由16.5%上升至65.69%,并求得48 h IC50為0.845 μg/mL;給藥72 h后,抑制率由22.38%上升至82.16%,表明毛蘭素對Caco-2細胞的抑制率隨著藥物濃度的增加而升高。同樣,當藥物濃度相同時,隨著作用時間的延長,毛蘭素對Caco-2細胞的抑制率也呈現明顯的升高趨勢。表明毛蘭素對細胞的增殖抑制作用具有劑量時間效應。

圖1　毛蘭素對Caco-2細胞的抑制作用Fig.1　The inhibition of erianin on Caco-2

2.2毛蘭素對細胞形態的影響

如圖2所示,顯微鏡可以看到對照組細胞密度大、細胞邊緣光滑且貼壁性好。給藥組細胞隨給藥濃度增大細胞生長緩滯,細胞數量比對照組少,連接消失、細胞間隙增大,皺縮成團,隨著藥物濃度增加漂浮細胞較多,死亡數量增加,并且細胞貼壁緊實程度下降出現細胞典型的凋亡形態特征。

圖2　毛蘭素對細胞形態影響(400×)Fig.2　The effect of erianin on cell morphology(400×)

2.3共聚焦熒光顯微鏡檢測細胞膜電位水平

JC-1是一種碳氰化合物類陽離子熒光染料,可跨膜進入活細胞內定位于線粒體膜上,特異性地與線粒體內膜結合,只在細胞發生凋亡線粒體膜電位崩解時才釋放出來,呈綠色熒光[14],見圖3。由圖3可知,對照組細胞呈明顯的橙色,隨著給藥濃度增加,給藥組細胞線粒體膜的綠色熒光信號逐漸增強,線粒體膜電位崩解,表明藥物對細胞的凋亡誘導作用隨給藥濃度增大逐漸增強。

圖3　毛蘭素對線粒體膜電位的影響Fig.3　Impact of erianin on mitochondrial membrane potential

2.4毛蘭素對細胞核形態的影響

細胞核形態變化如圖4所示,經毛蘭素處理48 h后,Caco-2細胞的生長增殖狀態明顯受到藥物影響而產生抑制作用,由圖中可以看出Caco-2細胞已經出現了凋亡細胞會產生的典型形態學特征變化,如細胞的體積減小,細胞質的密度增加以及細胞核固縮直至碎裂等狀態,圖中箭頭指的是破裂的細胞核,隨著藥物濃度增加,可以看出破碎細胞核量增加。

圖4　毛蘭素對細胞核形態影響Fig.4　The effect of erianin on nuclear morphometry

2.5毛蘭素對細胞凋亡率的影響

分別以不同濃度的毛蘭素作用于Caco-2細胞,給藥48 h后,觀察藥物作用后細胞凋亡率的變化與對照組比較(圖5),毛蘭素濃度為0.15、0.3、0.60、1.20 μg/mL時,總凋亡率分別為14.08%、29.26%、37.48%、53.02%,凋亡率依次增加,由表1可知,早期凋亡率和晚期凋亡率也隨濃度增加而升高。

圖5　毛蘭素對細胞凋亡的影響Fig.5　Effect of erianin on apoptosis rate of Caco-2 cells注:Q1代表早期凋亡,Q2代表晚期凋亡。

毛蘭素濃度(μg/mL)早期凋亡率(48h)晚期凋亡率(48h)03.94±0.641.31±0.230.157.06±0.745.7±0.96**0.312.8±1.04**16.7±1.73**0.613.84±2.04**22.1±1.71**1.223.7±2.47**29.4±1.58*

注:*p<0.05,**p<0.01,與0 μg/mL毛蘭素空白對照組比較。

2.6毛蘭素對細胞周期分布的影響

為探明毛蘭素對細胞周期的影響,利用流式細胞儀分析Caco-2細胞在對照組以及0.15、0.3、0.60、1.20 μg/mL毛蘭素處理后的細胞周期分布的狀況。由圖6可知,不同濃度的毛蘭素處理Caco-2細胞48 h后,細胞周期被阻滯于G2期,隨著毛蘭素濃度的增加,可見G1期細胞比例下降以及G2期比例上升,表明毛蘭素能誘導G2期阻滯從而抑制Caco-2細胞生長。

圖6　毛蘭素對細胞周期的影響Fig.6　Influences of erianin on on cell cycle

2.7Western Blot檢測Caspase-3的表達

為進一步探明毛蘭素誘導結腸癌細胞Caco-2凋亡的分子機制,用0(空白對照組)、0.6、1.2 μg/mL毛蘭素處理Caco-2細胞并提取細胞總蛋白,通過Western Blot檢測其對Caspase-3蛋白表達的影響。由圖7可知,0.6、1.2 μg/mL毛蘭素處理細胞后發現Caspase-3被剪切的17 ku小分子活性片段,表明Caspase-3被激活,而未加藥組未見被剪切的17 ku小分子活性片段。正常情況下細胞中的Caspase-3無活性,以酶原(Procaspase-3)的形式存在,當細胞接受凋亡刺激時,它被系列反應激活被剪切為17 ku(Cleaved caspase-3)的活性小分子片段,進而誘導細胞發生凋亡[15-16],由結果可見藥物處理細胞后caspase-3被剪切為17 ku的小分子片段,表明毛蘭素可能是通過線粒體途徑誘導細胞凋亡的,但其具體的分子調控機制則尚需近一步研究。

圖7　毛蘭素對caspase-3活性影響Fig.7　Effect of erianin on caspase-3 activity注:條帶由左至右依次為0 μg/mL對照組、毛蘭素濃度0.6、1.2 μg/mL。

3　討論與結論

細胞凋亡又稱細胞程序性死亡,是一個非常復雜的調控過程[1],近年來成為腫瘤治療的研究熱點,細胞在多種調控因子的共同作用下引起凋亡,在這個過程中細胞發生緊縮、膜上起泡、核染色質固縮于邊緣、DNA片段化等。很多的抗腫瘤藥物,例如化療藥物、激素都能夠引起腫瘤細胞發生凋亡[17]。腫瘤細胞的死亡大部分是通過凋亡發生的,凋亡對腫瘤的抑制起到重要作用。研究表明,哺乳細胞中有三條信號通路導致凋亡的發生[18],分為內源信號通路、外源信號通路與內質網通路,內源信號通路是通過線粒體調控,因此也叫做線粒體通路。參與內源信號通路的蛋白包含Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白等[19],其中Caspase-3是線粒體通路重要的執行蛋白,是調控細胞凋亡的重要因子,Caspase-3被剪切活化后大致通過以下3種機制誘導細胞凋亡[20]:酶解凋亡抑制物,如Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白Bcl-2等；酶解細胞外基質,如細胞周期素依賴性激酶抑制因P21等；剪切失活DNA修復因子,如PARP(多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶)。在細胞受到藥物刺激后線粒體跨膜電位崩解、線粒體基質內滲透壓升高、內膜腫脹[21],誘使位于線粒體膜間隙的細胞色素C釋放到胞漿中,而釋放到胞漿中的細胞色素C結合凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1形成復合體,激活Caspase連級反應激活下游的Caspase-3,從而誘導細胞凋亡[22-24],實驗中經毛蘭素處理的細胞中檢測到Caspase-3被剪切激活的17 ku(Cleaved caspase-3)小分子片段,同時也檢測到細胞線粒體膜電位的改變,表明毛蘭素可能是通過影響線粒體功能,引起線粒體跨膜電位改變激活caspase-3活性進而誘導細胞凋亡的。

綜上所述,本研究證明毛蘭素在一定程度上能抑制Caco-2細胞的增殖,呈時間劑量效應,能誘導Caco-2細胞凋亡,誘導胞內線粒體膜電位的改變及誘導細胞周期阻滯于G2期,同時Western Blot檢測到Caspase-3被激活活性片段,表明毛蘭素可能是通過線粒體途徑誘導細胞凋亡的,但其誘導細胞凋亡是否有其他通路的參與尚需進一步實驗證明,同時毛蘭素化學結構與抗癌活性之間的相互關系尚需深入研究。

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Erianin induces apoptosis of human colorectal cancer Caco-2 cells

CUI Ming-yang1,2,KANG Dan-dan1,HE Lei1,SHI Yu-jie2,REN Jian-wu1,*

(1.Beijing Forestry University,College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing 100083,China;2. Peking University Health Science Center,School of Pharmaceutical Science,Beijing 100191,China)

Objective:Growth inhibition effects of erianin on human colorectal cell line Caco-2 cells and its possible mechanism were studied. Methods:SRB assay was employed to evaluate the anti-proliferation effect of erianin on Caco-2 cells.The morphological changes of treated Caco-2 cells were observed with 33342 staining.Cell cycle distribution and the proportion of apoptotic cells were evaluated using flow cytometry. Western Blotting analysis was used to detect the expressions of apoptosis related protein Caspase-3. Results:Erianin inhibited proliferation of Caco-2 cells in a dose-and time-dependent manner and leaded to cell apoptosis.The IC50value was 0.845 μg/mL after 48 h exposure to erianin. Cell cycle was arrested in G2phase. It was also observed that the expression of activity fragmentation of Caspase-3 showed a significant increase. Conclusion:Erianin could inhibit the proliferation of Caco-2 cells and the apoptosis of Caco-2 cells induced by erianin may be associated with mitochondrial pathway.

erianin;Caco-2;apoptosis;DendrobiumchrysotoxumLindl

2016-03-04

崔名揚(1995-)，女，大學本科，研究方向: 天然產物研究與開發，E-mail：18701590313@163.com。

任建武(1967-)，男，副教授，研究方向: 天然產物研究與開發，E-mail：jianwur@sina.com。

國家自然科學基金項目(31572149)；國家級大學生創新創業訓練計劃(201510022029)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0352-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.062