不同方法提取絞股藍總皂苷的比較研究

楊婧娟,何少貴,趙夢琦,張　希,*

(1.云南中醫學院,云南昆明 650500;2.廈門華夏學院,福建廈門 361024)

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不同方法提取絞股藍總皂苷的比較研究

楊婧娟1,何少貴2,趙夢琦1,張希1,*

(1.云南中醫學院,云南昆明 650500;2.廈門華夏學院,福建廈門 361024)

以常規乙醇回流法、酶法及微生物發酵法提取絞股藍總皂苷,通過總皂苷含量、單體皂苷組分、抗氧化活性三方面對不同提取方法進行比較研究。結果顯示,復合酶法提取所得絞股藍總皂苷含量達7.69%,比常規回流法相對提高了31%,但對皂苷組分轉化未見顯著效果。微生物發酵提取破壁效果最佳,提取物中絞股藍總皂苷含量達8.34%,比回流提取法所得含量相對提高了42.1%;經發酵處理后,絞股藍總皂苷中活性更強的次級苷組分如絞股藍皂苷V-AH(人參皂苷Rg3)等含量增加,對DPPH·清除的IC50值相比常規法由1.544 mg/mL降至0.562 mg/mL,對Fe3+還原力的VC當量抗氧化能力AEAC值提高至(236.299±12.785)mg VC/g固形物,顯示出該方法的優越性。

絞股藍總皂苷,提取,酶法,微生物發酵,抗氧化活性

絞股藍(GynostemmapentaphyllumMakin.)為葫蘆科絞股藍屬多年生草本藥食兩用資源,主要活性成分為絞股藍皂苷,具有與人參皂苷相同的四環三萜達瑪烷型結構,其中部分單體絞股藍皂苷與人參皂苷同物異名[1]。藥理學研究表明,絞股藍總皂苷及其中的部分單體皂苷具有血糖、血脂調節、腫瘤抑制、抗氧化、抗衰老、增強免疫等功效[2],在保健食品及藥品研發中具有廣闊的應用前景,因此,探究有效的提取方法以獲取活性成分具有重要意義。

目前關于絞股藍總皂苷提取的研究只注重其提取率的提高,并未關注在提取率提高的同時,提取方法對絞股藍總皂苷中組分單體結構的影響,而構效關系研究已充分表明其中單體皂苷的結構直接關系其生物利用率及生物活性。如生藥中含量較多的絞股藍皂苷Ⅲ(人參皂苷Rb1)等的分子結構并不是活性最佳狀態,通過水解皂苷側鏈糖基轉化為低糖鏈次級苷絞股藍皂苷V-AH(人參皂苷Rg3)后,才顯示出較強的抗腫瘤活性[3-4]。然而,Rg3等作為稀有皂苷在生藥中含量甚微,主要由含量相對高的主皂苷轉化而得。因此,尋找一種提取方法,可以在提高絞股藍總皂苷提取率的同時,又能對其中單體皂苷起到結構修飾作用,轉化為活性更高的稀有皂苷成為亟待解決的關鍵問題。

本研究主要應用常規乙醇回流法、酶法和微生物發酵法提取絞股藍總皂苷,通過活性成分含量、單體皂苷組分、抗氧化活性三方面對不同提取方法進行比較研究,為有效獲取更高活性的絞股藍總皂苷提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

絞股藍藥材干燥粉碎后過40目篩備用，購自張仲景大藥房,產地安徽亳州;綠色木霉云南中醫學院食品微生物實驗室;人參皂苷標準品:人參皂苷Rb1、Rd、Rg3、F2購自南京澤朗醫藥科技;DPPH、抗壞血酸購自Aladdin;纖維素酶:20000 U/g、果膠酶:30000 U/g購自深圳恒生生物科技有限公司;所用其他試劑均為分析純。

SW-CJ-2D型超凈工作臺蘇州凈化設備有限公司;LDZX-40BI型滅菌鍋上海申安醫療器械廠;UV-1800PC型紫外-可見分光光度計翱藝儀器(上海)有限公司;LRH-250生化培養箱上海醫療器械五廠;DK-98ⅡA型水浴鍋天津市泰斯特儀器有限公司;SC-3614型離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1絞股藍總皂苷的提取方法

1.2.1.1乙醇回流法取一定量絞股藍藥材,按料水比1∶10加入75%乙醇,置于80 ℃回流提取2次,每次90 min,合并兩次收集的上清液,定容,備用[5]。

1.2.1.2酶法纖維素酶法:取一定量絞股藍藥材,按80 U/g生藥用量加入纖維素酶,調pH5.0,置于50 ℃酶解2 h,然后加入75%乙醇于80 ℃提取90 min,收集上清液,定容,備用。

果膠酶法:取一定量絞股藍藥材,按150 U/g生藥用量加入果膠酶,調pH為4.0,置于50 ℃酶解2 h,加入75%乙醇于80 ℃提取90 min,收集上清液,定容,備用。

復合酶法:取一定量絞股藍藥材,按每克生藥加入80 U纖維素酶和150 U果膠酶的用量進行復合酶解,調pH為4.5,置于50 ℃下酶解2 h,加入75%乙醇于80 ℃提取90 min,收集上清液,定容,備用[6]。

1.2.1.3微生物發酵法取一定量絞股藍藥材與輔料麩皮按3∶2比例混勻后滅菌備用,接種5%綠色木霉,于30 ℃培養5 d,加入75%乙醇于80 ℃提取90 min,收集上清液,定容,備用。

1.2.2絞股藍總皂苷含量測定

1.2.2.1標準方程建立[7]精密稱取干燥至恒重的人參皂苷Rb1標準品5 mg,加入甲醇溶解定容至5 mL,制成1 mg/mL的標準溶液,分別取20、40、60、80、100 μL于具塞試管中,水浴揮干其中溶劑,分別加入5%香草醛冰醋酸溶液(現用現配)0.2 mL、高氯酸0.8 mL,搖勻后于60 ℃恒溫水浴15 min,取出立即置冷水中冷卻,各加入冰醋酸5 mL,搖勻,以甲醇為試劑空白,在波長550 nm處測定吸光度值。以吸光度值A為縱坐標,以皂苷質量濃度為橫坐標繪制標準曲線:Y=0.962x-0.021,R2=0.999。

1.2.2.2樣品測定取各樣品提取物稀釋2倍,按標準物質方法操作測定樣品中絞股藍皂苷的含量(%)。

1.2.3絞股藍總皂苷提取物薄層層析(TLC)檢測分別取樣品5 μL,用毛細管點于薄層層析板上,置于層析缸中展開,其中展開劑為氯仿、甲醇、水(體積比為7∶3∶0.5),當展開至離頂部邊緣約1 cm時取出,吹干板上溶劑,噴灑10%硫酸乙醇溶液,置于121 ℃,10 min,顯色[8]。

1.2.4絞股藍總皂苷提取物抗氧化活性測定DPPH自由基清除法測定抗氧化能力[9]:將提取液濃縮干燥成固形物后制備成濃度分別為0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mg/mL的絞股藍總皂苷提取物樣液,各取1.5 mL,分別加入 2.5 mL 濃度為6.5×10-5mol/L DPPH乙醇溶液中,避光反應20 min,測定其在波長517 nm處的吸光度Ai;測定1.5 mL 50%乙醇溶液與2.5 mL DPPH溶液混合后在波長517 nm處吸光度A0;測定1.5 mL提取物樣液與2.5 mL 50%乙醇溶液反應后在波長517 nm處吸光度Aj。實驗重復3次,計算絞股藍總皂苷提取物自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100。以抗壞血酸(VC)為參照,同操作測定不同濃度VC對DPPH自由基清除率。實驗結果以各樣品清除率達到50%時的作用濃度(IC50值)表示其對DPPH自由基的清除能力。

鐵離子還原能力測定[10]:將提取液濃縮干燥成固形物后制備成0.6 mg/mL的絞股藍總皂苷提取物樣液,各取1.0 mL,分別加入2.5 mL 濃度0.2 mol/L磷酸緩沖液、2.5 mL濃度1%的鐵氰化鉀溶液,置于50 ℃水浴20 min,取出后迅速冷卻,加入2.5 mL濃度10%三氯乙酸溶液,離心10 min后取上清液2.5 mL,再加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL濃度0.1%三氯化鐵溶液,混勻后反應10 min,測定其在波長700 nm處的吸光度值,實驗重復3次。另以不同濃度抗壞血酸(VC)同操作繪制標準曲線(y=0.899x+0.008,R2=0.994),計算絞股藍總皂苷提取物的VC當量抗氧化能力AEAC(ascorbic acid equivalent antioxidant capacity)。

2　結果與分析

2.1酶法對絞股藍總皂苷提取的影響

以不同的酶對絞股藍總皂苷進行提取,提取物含量結果如圖1所示。應用酶法提取所得絞股藍總皂苷含量均高于常規乙醇回流法所得,其中酶法所得提取物含量:果膠酶法<纖維素酶法<復合酶法,經過復合酶酶解,使提取物中絞股藍總皂苷含量達到7.69%,比回流法(5.87%)相對提高了31%。復合酶集合了纖維素酶和果膠酶,兩種酶共同發揮作用,破壞植物組織細胞壁的致密性,可以有效降解細胞壁及細胞間質中的果膠、纖維素等,利于活性成分溶出,提高提取率[11],提取效果明顯優于單獨使用纖維素酶、果膠酶。

圖1　不同提取方法所得絞股藍總皂苷含量Fig.1　The concentration of total gypenosidesextracted by different methods

不同方法所得絞股藍總皂苷的人參皂苷組分如圖2所示,與常規乙醇回流法相比,酶法提取對絞股藍總皂苷中人參皂苷組分無顯著影響。色譜板b顯示提取效果較優的復合酶法所得總皂苷中單體皂苷組分與回流法提取物基本一致。比較三種不同酶解效果,色譜板a顯示纖維素酶法提取物在Rf 4.1處的點相比果膠酶及復合酶法提取物顏色略淺,提示該組分有一定程度的降解,其他組分無明顯異同。說明酶法提取絞股藍總皂苷主要優勢在于破壁、促進有效成分溶出,對組分轉化未見顯著效果。

圖2　不同方法所得絞股藍總皂苷TLC圖譜Fig.2　The TLC of total gypenosidesextracted by different methods注:a中數字:1.復合酶提取法;2.果膠酶提取法;3.纖維素酶提取法;b中數字:1.復合酶提取法2.乙醇回流法。

2.2微生物發酵法對絞股藍總皂苷提取的影響

以綠色木霉發酵絞股藍后提取所得絞股藍總皂苷含量為8.34%,相比常規回流提取法,提取物含量相對提高了42.1%,提取效果也優于復合酶提取法,結果如圖3所示。微生物發酵提取與酶法提取本質相同,主要是利用酶對植物組織產生破壁作用,而微生物在發酵過程中可產生豐富酶系協同發揮作用,如綠色木霉可分泌纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、糖苷酶等胞外酶,因此效果優于簡單的酶疊加,可顯著提高細胞壁的通透性,強化提取效率。

圖3　不同提取方法所得絞股藍總皂苷含量Fig.3　The concentration of total gypenosides extracted by different methods注:1.乙醇回流法;2.復合酶提取法;3.微生物發酵法。

圖4　不同方法所得絞股藍總皂苷TLC圖譜Fig.4　The TLC of total gypenosides extracted by different methods注:TLC中數字表示:1.微生物發酵法;2.乙醇回流法;TLC中字母對應Rf值:a:0.35;b:1.0;c:1.45;d:1.6;e:1.75;f:2.1;g:2.6;h:1.5;i:0.5。

圖5　絞股藍皂苷組分轉化分析圖Fig.5　Transformation analysis of gypenoside component

2.3不同方法提取對絞股藍總皂苷提取物抗氧化活性的影響

由表1抗氧化能力測定結果可知,復合酶法及發酵法提取的絞股藍總皂苷抗氧化能力優于常規乙醇回流提取物,其中發酵法提取物抗氧化能力最佳,其對DPPH·清除的IC50值相比常規法由1.544 mg/mL降至0.562 mg/mL,對Fe3+還原力提高至(236.299±12.785) mg VC/g固形物,提示發酵處理對絞股藍總皂苷提取物的抗氧化活性帶來一定影響。

由于復合酶法及微生物發酵法提取物中絞股藍總皂苷含量相對較高,因此,在相同固形物濃度下,總皂苷含量越高可能造成抗氧化能力越強,即活性物質含量與抗氧化活性呈正比例關系。另外,在三種提取方法中,發酵法提取物中皂苷組分相對發生了變化,一些次級苷如Rd、Rg3含量增加等,這些轉化可能導致總皂苷抗氧化活性受到影響。有研究表明人參皂苷抗氧化活性的高低與單體皂苷之間的協同作用有關[14-15],發酵過程使絞股藍皂苷組分的構成和比例發生改變,必然會帶來組分間協同作用的差異,可能進一步影響其抗氧化活性。

表1　不同提取方式所得絞股藍總皂苷的抗氧化能力

注:不同上標字母表示在p<0.05水平下差異顯著。

3　結論

應用酶法和微生物發酵法提取所得絞股藍總皂苷含量均高于常規乙醇回流法提取物。比較不同酶法提取,復合酶法效果優于單獨使用纖維素酶及果膠酶,經過復合酶酶解,使提取物中絞股藍總皂苷含量達到7.69%,比回流法(5.87%)相對提高了31%,但對皂苷組分轉化未見顯著效果。微生物發酵提取破壁效果最佳,提取物中絞股藍總皂苷含量達8.34%,比回流提取法含量相對提高了42.1%;經發酵處理后,絞股藍總皂苷中單體皂苷組分相對發生了變化,一些活性更強的次級苷如Rg3含量增加;而絞股藍皂苷含量及組分構成、比例的改變對其活性產生了影響,表現為發酵提取樣對DPPH自由基清

除能力及還原力顯著提高。綜合比較三種方法,微生物發酵法不僅能提高活性物質的溶出率,在發酵過程中藥材本身相當于誘導物,可使微生物定向產生特異性水解酶實現生物轉化,絞股藍總皂苷抗氧化活性也顯著提高,顯示出該方法的優越性。但本研究中關于發酵提取樣單體皂苷間的轉化,對已知成分還需定量分析、對未確定成分還需進一步研究確定其成分歸屬,為微生物發酵法應用于天然活性物質的提取提供科學參考。

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Compared study on extraction of total gypenosides by different methods

YANG Jing-juan1,HE Shao-gui2,ZHAO Meng-qi1,ZHANG Xi1,*

(1.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China;2.Xiamen Huaxia University,Xiamen 361024,China)

To study the extraction effects of traditional reflux techniques,enzyme techniques,microbial fermentation techniques,the content,consititude,antioxidant activities of total gypenosides were evaluated. The results exhibited that the total gypenosides contents by complex enzyme method were reached to 7.69%,Which increased by 31% comparing with traditional method,but transformation of saponins constituents did not detected signiflcantly by the enzyme techniques. The wall-breaking extraction effects of fermentation method was most excellent,the total gypenosides contents by this method were reached to 8.34%,Which increased by 42.1% comparing with traditional method,and transformation of component saponins involved in the fermentation process,such as the contents of gypenosides V-AH(ginsenoside Rg3)were increased. Due to fermentation,IC50of DPPH radical scavenging capacity was reduced from 1.544 to 0.562 mg/mL comparing with traditional method,and ascorbic acid equivalent antioxidant capacity on reducing power of Fe3+were reached to(236.299±12.785) mg VC/g solids. In summary,the microbial fermentation extraction method was prior to other methods.

total gypenosides;extraction;enzyme techniques;microbial fermentation;antioxidant

2016-02-17

楊婧娟(1986-)，女，碩士，助教，研究方向:天然產物研究與開發,E-mail：yjj23@126.com。

張希(1982-)，女，博士，講師，研究方向:藥食資源開發與利用,E-mail：zhangxi1030@hotmail.com。

云南省教育廳科學研究基金項目(2014Y230)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)16-0269-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.045