米曲霉A-F04的β-果糖基轉移酶基因的克隆鑒定及其生物信息學分析

高　斌,李　棒,李　婭,李　斌,劉成梅,付桂明,*

(1.南昌大學,食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學,中德食品工程中心,江西南昌 330047;3.南昌大學食品學院,江西南昌330031)

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米曲霉A-F04的β-果糖基轉移酶基因的克隆鑒定及其生物信息學分析

高斌1,2,3,李棒3,李婭3,李斌1,2,3,劉成梅1,2,3,付桂明1,2,3,*

(1.南昌大學,食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學,中德食品工程中心,江西南昌 330047;3.南昌大學食品學院,江西南昌330031)

以實驗室前期篩選出的高產β-果糖基轉移酶(β-fructosyltransferase,β-FTase)的米曲霉(Aspergillusoryzae)菌株A-F04出發,提取米曲霉A-F04基因組DNA和RNA,采用PCR和RT-PCR技術克隆β-FTase基因,得到β-FTase基因完整編碼序列和內含子序列,利用重組技術構建β-果糖基轉移酶質粒基因庫,并構建基因的進化樹,預測β-FTase分子量、等電點、氨基酸組成等物化性質,預測其N-糖基化位點和信號肽,運用SWISS-MODEL對β-FTase的三級結構預測。結果顯示,成功鑒定出菌株A-F04具有β-FTase基因;菌株A-F04的β-FTase基因編碼區長度為1630 bp,含有一個52 bp的內含子,位于173 bp與224 bp之間;編碼序列的開放閱讀框總長為1578 bp;軟件分析得知β-FTase為親水性的穩定蛋白,其分子量為57.4653 ku,理論等電點為4.83,由525個氨基酸組成;可能的N-糖基化位點有6處;信號肽分析軟件得知其編碼的1～17位置處的氨基酸為信號肽;SWISS-MODEL構建的3個模型質量較高,有利于后期對β-FTase的結構和功能的研究。

米曲霉A-F04,β-果糖基轉移酶,基因鑒定,生物信息學分析

β-果糖基轉移酶(β-fructosyltransferase,β-FTase,EC 2.4.1.9)能以蔗糖為反應底物,催化合成低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)[1-2]。FOS對改善腸道功能、防治便秘和腹瀉、提高免疫力、促進礦物質吸收等具有特殊的生理功效,在食品、醫藥等領域應用市場巨大。在自然條件下,主要從植物中獲取FOS,此種方法較為困難,且產量少,工業上主要用β-FTase酶來催化合成FOS[3-7]。

經研究發現,含有β-FTase基因的微生物包括黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、青霉屬(Penicillium)及屈芽短梗菌(Aureobasidiumpullulans)等,其中米曲霉分泌和表達β-FTase能力較強,且具有極高的食品安全性,被美國FDA 認證為GRAS的菌種之一。2005年日本科學家[8]完成了米曲霉基因組測序工作,這為基因工程選育米曲霉β-FTase高效表達菌株奠定了基礎。目前,對米曲霉的β-FTase基因研究已成為國內外熱點。王玉海[9]等把一株原始米曲霉菌株的β-FTase基因進行了克隆并進行了外源表達,對于米曲霉的β-FTase基因尚未進行信號肽、N-糖基化位點等生物信息分析;國外對米曲霉產β-FTase的研究主要集中在發酵條件優化方面[10],在生物信息學分析和外源表達方面較少。本實驗以前期篩選出的高產β-FTase的米曲霉A-F04為出發菌株,采用PCR和RT-PCR技術克隆[11]出β-FTase的基因,通過基因測序手段和DNA man軟件分析獲取得到β-FTase的DNA序列、RNA序列和內含子序列。以此為基礎,對β-FTase基因的生物信息學進行分析,探究信號肽位置、構建生物進化樹,預測其蛋白質的物化性質、蛋白質跨膜結構區域,并進行氨基酸疏水性分析和同源模型的構建。以期為深入研究米曲霉A-F04表達β-FTase及其原核或真核的外源表達奠定良好的基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

米曲霉(Aspergillusoryzae)A-F04南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室保藏;大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α(含pPIC9K質粒)中山大學贈送;大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α南昌大學中德食品工程中心保藏;PDA培養基馬鈴薯200 g,加800 mL蒸餾水煮沸后雙層紗布過濾,取濾液,葡萄糖20 g,固體另加1.5%(m/v)的瓊脂,蒸餾水定容至1 L,自然pH;發酵優化培養基酵母粉1.5 g,(NH4)2SO41.5 g,蔗糖4 g,NaCl 2 g,固體另加1.5%(m/v)的瓊脂,蒸餾水定容至1 L,pH7.0;LB培養基酵母粉5 g,胰蛋白胨10 g,NaCl 10 g,固體另加1.5%(m/v)的瓊脂,蒸餾水定容至1 L,pH調至7.0;酵母粉阿拉丁試劑,BR純度;瓊脂粉上海山浦,BR純度;胰蛋白胨北京奧博星;乳酸石炭酸棉藍染色液北京百浩;PCR產物柱純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、dNTP、DNA Marker、SnabⅠ和NotⅠ限制性內切酶大連Takara寶生物;AGAROSE G-10法國Biowest;GoldView北京博凌科為;T4DNA連接酶NEB;RNase酶、RNA提取試劑盒(批號DP432)和cDNA第一鏈合成試劑盒(批號M1125)、氨芐青霉素北京天根;(NH4)2SO4、氯化鈉、蔗糖、NaCl、SDS等國產分析純。

BA410光學顯微鏡Phenix;HWS-250型恒溫恒濕培養箱上海森信實驗儀器有限公司;ZDX-35BI型座式蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠;ZHWY-2102C型恒溫培養振蕩器上海智誠分析儀器制造有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵鞏義市英峪予華儀器廠;2720 Thermal Cycler美國應用生物系統公司;Thermo cell Cooling & Heating Block杭州博日科技有限公司;DYY-8C型電泳儀、DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳槽北京市六一儀器廠;TGL-16B型高速離心機、NanaDrop 2000超微量分光光度計美國熱電;凝膠成像系統美國Bio-rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌株A-F04形態學鑒定取用PDA斜面保藏的菌株A-F04在35 ℃(通過實驗室前期探究,在此溫度下米曲霉A-F04生長速度適宜和菌絲體均勻)活化2～3 h后,在發酵優化培養基平板上劃線,35 ℃,恒溫恒濕培養2～7 d,觀察菌株A-F04菌落、孢子菌絲體形態,35 ℃，200 r/min進行搖瓶發酵培養,觀察米曲霉A-F04菌球。挑取單菌落孢子,乳酸石炭酸棉藍染色液染色后制片,進行鏡檢。

1.2.2菌株A-F04的β-FTase基因鑒定

1.2.2.1孢子懸浮液制備配制固態發酵優化培養基于121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min,分裝試管冷卻后制成斜面備用。用接種環接種菌株A-F04孢子,斜面劃線,35 ℃恒溫恒濕靜置培養72 h后,用滅菌生理鹽水洗脫斜面,制備菌株A-F04的孢子懸浮液,孢子懸浮液倒入100 mL含有滅菌玻璃珠的三角瓶中,充分搖勻后用血球計數板計數。

1.2.2.2米曲霉基因組提取、純化及質量鑒定接種1%的米曲霉A-F04孢子懸浮液于液體發酵優化培養基中,在35 ℃,200 r/min培養96 h后,無菌條件下真空抽濾獲取菌絲體,液氮預冷研磨。米曲霉基因組的DNA提取采用SDS法;總RNA提取方法參照TIANGEN公司總RNA提取試劑盒步驟;參照TIANGEN公司反轉錄試劑盒合成cDNA。用NanaDrop 2000超微量分光光度計對提取的米曲霉菌株A-F04的DNA和RNA進行檢測,DNA和RNA樣品的A260/A280比值在1.8～2.0之間,則表示樣品中蛋白和酚類物質污染少,DNA和RNA樣品的A260/A230比值大于2.0,則表明樣品中碳水化物和鹽物質污染少,提取的DNA和RNA較純凈,達到PCR擴增研究要求[12]。

隨著幼兒年齡的不斷增長，其閱讀的書籍也會隨之深入和量增，通過閱讀不同的書籍，從而產生不同的閱讀興趣，實現幼兒全面發展能力的提高。因此，綜上所述，在學生幼兒時期，運用恰當的實踐策略培養幼兒良好的閱讀習慣對于促進幼兒各方面發展來說，具有重要的意義。

電泳壓力設定為100 V,電泳時間為35 min,采用1.2 %瓊脂糖凝膠[12]對核酸樣品進行電泳,電泳結束后用凝膠成像系統對電泳條帶進行分析。

1.2.2.3引物的設計與合成根據GenBank公布的米曲霉AspergillusoryzaeN74[13]生物合成β-果糖基轉移酶的基因序列(登錄號:GU145136),可知,β-FTase編碼區基因包括兩端的2個外顯子和中間的1個內含子,結合質粒pPIC9K的酶切位點和引物設計原則,分析設計了1對特異性擴增引物和1對AOX1基因的通用引物,引物的序列、酶切位點(SnabⅠ和NotⅠ)和保護堿基如表1(引物交由華大基因科技服務有限公司合成)。

表1　PCR擴增引物

表2　PCR反應體系和擴增條件

1.2.2.4編碼區和編碼序列的克隆對于編碼區序列,以基因組DNA為模板,P1和P2為引物進行PCR;對于編碼序列,以基因組RNA反轉錄所得的cDNA為模板,P1和P2為引物進行PCR。其PCR反應體系和擴增條件見表2。PCR產物送至華大基因反復測序,得到編碼區序列和編碼序列。運用DNA man軟件,測序結果與NCBI公布的米曲霉N74β-FTase基因序列進行BLAST比對,進行同源和差異性分析。

1.2.2.5米曲霉A-F04的β-FTase的載體基因庫的構建為方便后續對β-FTase基因的研究,柱純化編碼序列的PCR產物,提取大腸桿菌DH5α-pPIC9K的質粒pPIC9K,用SnabⅠ和NotⅠ進行雙酶切,酶切后分別進行電泳。用瓊脂糖回收試劑盒對電泳條帶進行切膠回收純化,純化后分別用NanaDrop 2000超微量分光光度計檢測酶切后的pPIC9K和PCR產物的量,按照PCR產物量(mol)∶pPIC9K量(mol)=3∶1～6∶1配制酶連反應體系。制備大腸桿菌DH5α感受態[12],將連接產物進行大腸桿菌DH5α轉化。使用氨芐青霉素抗性培養,篩選陽性基因庫克隆子DH5α(pPIC9K-FTase),陽性克隆子DH5α(pPIC9K-FTase)用5′AOX1和3′AOX1通用引物進行菌液PCR進一步驗證,電泳條帶切膠回收后送至華大基因反復測序進行最終確認。

1.2.3菌株A-F04的β-FTae基因的生物信息學分析在NCBI里檢索β-FTase基因序列,運用MEGA 5.10工具對來源不同的菌種的β-FTase蛋白進行同源性分析,構建進化樹。根據菌株 A-F04的β-FTase測序結果,運用ExPASy中的ProtParam tool分析蛋白質的物理化學性質,分析預測其分子量、理論等電點、氨基酸組成、帶正負電荷的殘基數、分子元素和不穩定系數。運用美國CBS的TMHMM Server v. 2.0預測并分析蛋白質跨膜結構區域。運用ExPASy的ProtScale工具對β-FTase氨基酸序列進行疏水性分析。運用Signal P對β-FTase信號肽進行預測和分析。運用NetNGlyc 1.0 Server對Β-FTase進行N-糖基化預測。運用基于同源建模的分析工具SWISS-MODEL進行β-FTase三級結構預測。

2　結果與分析

2.1菌株A-F04形態學分析

菌株A-F04斜面培養初期1～2 d呈淺黃色,第3 d菌絲呈黃綠色,繼續培養菌體將逐漸變為深綠色,取培養了72 h的菌株A-F04示例,其斜面孢子形態如圖1A。對培養72 h的菌株A-F04孢子進行沖洗,用乳酸石炭酸棉藍染色液染色后制片,進行鏡檢,1000倍顯微鏡下可清晰地分辨出分生孢子、頂囊、分生孢子梗和足細胞等曲霉屬結構,如圖1B。搖瓶發酵培養菌株A-F04,菌球大小均在0.1～2.0 cm之間,其菌球形態如圖1C所示,菌球表面有米曲霉特征的刺突結構。

圖1　A-F04菌體形態Fig.1　Morphology of A.oryzae A-F04注:A斜面孢子絲;B染色的孢子絲;C搖瓶培養菌球。

圖4　編碼序列PCR產物測序結果與A.oryzae N74 FTase序列對比Fig.4　Comparison of CDS PCR products and A.oryzae N74 FTase sequence

2.2.1DNA和RNA質量鑒定用NanaDrop 2000檢測DNA和RNA樣品,結果顯示菌株A-F04的DNA樣品濃度為(543.1±3.4) ng/μL,RNA樣品濃度(127.9±1.7) ng/μL,A260/A280在1.8～2.0之間,A260/A230大于2.0,達到PCR擴增研究要求。對總RNA進行電泳,如圖2所示,泳道1條帶清晰明亮,28 S條帶亮度為18 S條帶亮度的2倍左右,可知RNA質量良好。以此總RNA為模板,合成cDNA文庫,步驟參照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行。

圖2　菌株A-F04總RNA電泳圖Fig.2　Agarose gel electrophoresis of A.oryzae A-F04 RNA

2.2.2編碼區和編碼序列的克隆分析以菌株A-F04的DNA和cDNA為模板,P1和P2為引物進行PCR,克隆β-FTase的編碼區和編碼序列,電泳結果如圖3所示。泳道2為以DNA為模板的β-FTase基因編碼區的條帶,泳道1是以cDNA為模板的β-FTase基因編碼序列條帶,泳道2處條帶約1630 bp,泳道1處條帶約為1578 bp,符合預期。

圖3　菌株A-F04的β-FTase基因PCR產物電泳圖Fig.3　β-FTase gene PCR products from A-F04 strain注:泳道1為以cDNA為模板β-FTase基因的PCR產物,泳道2為以DNA為模板PCR產物。

2.2.3PCR產物測序和BLAST比對鑒定取編碼區和編碼序列的PCR產物,根據華大基因反饋的測序結果,減去引物和保護堿基的長度即為米曲霉β-FTase基因的長度。對比DNA和cDNA的PCR產物的長度,可知米曲霉A-F04的編碼區長度為1630 bp,編碼序列長度為1578 bp,在位置為173～224 bp之間含有一個長度為52 bp的內含子,將其序列與AspergillusOryzaeN74 FTase 的mRNA序列進行BLAST比對,如圖4,分析可知其同源性為100%,未發現堿基突變,成功鑒定本實驗中米曲霉A-F04菌株具有β-FTase基因。

2.2.4pPIC9K-β-FTase載體基因庫的構建SnabⅠ和NotⅠ限制性內切酶雙酶切質粒pPIC9K和純化后的編碼序列PCR產物,電泳如圖5所示,圖5-A泳道1為雙酶切后的質粒pPIC9K,大小為9000 bp左右,符合預期,圖5-B泳道1為雙酶切后的編碼序列PCR產物,大小為1570 bp左右,符合預期。

圖5　質粒pPIC9K雙酶切(A)及編碼序列PCR產物雙酶切(B)Fig.5　Electrophoretogram of pPIC9K after double enzyme digestion(A),Electrophoretogram of PCR product after double enzyme digestion(B)

用T4DNA連接酶并成功轉入至大腸桿菌DH5α,在含有氨芐青霉素抗性的LB培養基培養篩選,用5′AOX1和3′AOX1通用引物進行陽性重組子菌液PCR初步驗證,進行電泳,如圖6所示,泳道1條帶為1900 bp左右,符合預期。

圖6　重組菌菌液PCR驗證電泳Fig.6　Electrophoretogram of recombinantE.coli-pPIC9K-FTase PCR products

提取重組菌的質粒,用SnabⅠ和NotⅠ酶進行雙酶切,酶切后進行電泳,如圖7所示,條帶有2條,分別在9000 bp和1570 bp左右位置,符合質粒pPIC9K-FTase的大小要求,進一步驗證了重組菌為陽性。

圖7　重組質粒pPIC9K-FTase雙酶切驗證Fig.7　Double enzymes digestion of recombinant plasmid pPIC9K-FTase

PCR菌液測序所得的序列與FTase基因在DNA man軟件上比對結果顯示一致,最終確認pPIC9K-FTase載體基因庫構建成功。

2.3菌株A-F04的β-FTae基因的生物信息學分析

2.3.1同源進化樹分析在NCBI檢索到產FTase菌有放線菌(Actinomycesnaeslundii)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、曲霉(AspergillusruberCBS135680)、聚多曲霉(Aspergillussydowii)、多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)、Phleumpratense、酵母菌(Schwanniomycesoccidentalis)和鏈球菌(Streptococcusmutans)等。運用MEGA 5.10進行這些菌的同源性分析和進化樹構建,如圖8所示,米曲霉的β-FTase基因在進化樹上的位置處于酵母菌和細菌的β-FTase基因之間,合成β-FTase的米曲霉與同屬曲霉的紅曲霉親源較近,與酵母菌次之。除了以上微生物具有β-FTase基因,其他合成β-FTase的物種均屬于植物。

圖8　產β-FTase菌系同源性和統進化樹Fig.8　Homology and phylogenetic tree of β-FTase-producing strains

2.3.2物化性質預測分析運用ExPASy 中的ProtParam tool工具預測β-FTase理化性質,可知β-FTase分子量為57.4653 ku,理論等電點為4.83,由525個氨基酸組成(6.9% Ala、6.9% Arg、5.1% Asn、6.3% Asp、0.2% Cys、3.8% Gln、4.0% Glu、8.8% Gly、2.5% His、3.8% Ile、5.7% Leu、3.2% Lys、1.0% Met、6.9% Phe、5.9% Pro、10.7% Ser、8.4% Thr、2.5% Trp、4.0% Tyr、7.8% Val),帶正電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)數為54個,帶負電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)數為31個。FTase分子元素組成為C2597H3834N670O802S6,其不穩定指數為34.37,可知FTase為穩定蛋白。

2.3.3結構和性質預測分析運用TMHMM Server v.2.0 分析蛋白序列跨膜區分析得知,FTase是膜外蛋白,沒有跨膜結構域。運用ExPASy的ProtScale分析FTase親疏水性,可知FTase脂溶指數為66.65、總平均親水性為-0.292,可知FTase為親水性蛋白。

運用Signal P預測β-FTase的信號肽,如圖9所示,1～17位置處的氨基酸S值較高(每個氨基酸對應1個S值,信號肽區域的S值較高);在17位置處的氨基酸C值和Y值最高,可知17位置處氨基酸為信號肽剪切位點。

圖9　Signal P對β-FTase信號肽預測Fig.9　Prediction of β-FTase signal peptide

運用NetNGlyc 1.0 Server 對FTase進行N-糖基化預測,結果如圖10,可知β-FTase有6處可能性(>0.5)的N-糖基化位點,在氨基酸位置為59和204位置處幾率最大,其次是261和399位置處,107和437位置可能性稍弱。

圖10　β-FTase N-糖基化位點預測Fig.10　Prediction of β-FTase N-Glycosylation sites

運用基于同源建模的分析工具SWISS-MODEL進行FTase三級結構預測,預測出3種可能性結構,如圖11所示,模型A、B和C對應的模板分別是3kf3.1.A、3u75.1.A和3kf5.1.A。模型A對應的GMQE值和QMEAN4值分別為0.68和-7.16,模型B對應的GMQE值和QMEAN4值分別為0.68和-7.15,模型C對應的GMQE值和QMEAN4值分別為0.68和-8.86,構建的3個模型的GMQE(全球性模型質量估測)接近1,QMEAN4值小于0,評估結果表明3個模型立體結構上合理,模型質量較高[14-15]。通過同源模建獲得β-FTase的三維結構,有利于研究β-FTase的結構和功能,預測其催化反應的相互作用方式。

圖11　SWISS-MODEL同源建模預測β-FTase三級結構Fig.11　Tertiary structure of β-FTaseby homology tool SWISS-MODEL

3　結論

本研究以實驗室前期篩選出的高產β-FTase的米曲霉菌株A-F04為基礎,對該米曲霉菌株進行了β-FTase基因的克隆鑒定,成功驗證出菌株A-F04具有β-FTase的基因。對β-FTase基因進行了克隆,構建了β-FTase的質粒基因庫E.coli-pPIC9k-FTase,對β-FTase基因的編碼區和編碼序列進行了測序,成功獲取了β-FTase基因的編碼區、編碼序列和內含子序列。對菌株A-F04的β-FTase基因的生物信息學分析結果顯示,菌株A-F04的β-FTase基因編碼區長度為1630 bp,含有一個52 bp的內含子,位于173 bp與224 bp之間;編碼序列的開放閱讀框總長為1578 bp;軟件分析得知β-FTase為親水性的穩定蛋白,其分子量為57.4653 ku,理論等電點為4.83,由525個氨基酸組成;可能的N-糖基化位點有6處;信號肽分析軟件得知其編碼的1～17位置處的氨基酸為信號肽;SWISS-MODEL構建的3個模型質量較高。

本文克隆鑒定了菌株A-F04的β-FTase基因,并進行了序列分析及基因的功能預測,為深入研究該基因功能打下了良好的基礎。

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Cloning,identification and bioinformatics analysis ofβ-fructosyltransferase fromAspergillusoryzaeA-F04

GAO Bin1,2,3,LI Bang3,LI Ya3,LI Bin1,2,3,LIU Cheng-mei1,2,3,FU Gui-ming1,2,3,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Sino-German Food Engineering Center,Nanchang University,Nanchang 330047,China;3.Food Science and Technology College,Nanchang University,Nanchang 330031,China)

Based on the efficient expressingAspergillusoryzaestrain A-F04,the DNA and RNA of strain A-F04 were extracted,PCR and RT-PCR strategies were used to obtainβ-FTase sequences,thus,β-FTase gene bank was constructed. Evolutionary tree was built,and physicochemical property including formula weight,isoelectric point and amino acid composition were predicted,the possible glycosylation sites were predicted. SWISS MODEL tool was used to predictβ-FTase tertiary structure. Experimental results showed thatβ-FTase gene was successfully identified in strain A-F04. Strain A-F04’s coding region was 1630 bp,including an intron,between 173 bp and 224 bp,CDS were 1578 bp. Bioinformatics analysis program analysis showed thatβ-FTase was hydrophilic stable protein,its formula weight was 57.4653 ku,isoelectric point was 4.83,composed by 525 amino acids,within 6 possible glycosylation sites. Signal P program showed that the amino acids at 1 to 17 sites were signal peptide. The tertiary structure model constructed by SWISS-MODEL contributes to theβ-FTase’s structure and function exploration.

AspergillusoryzaeA-F04;β-fructosyltransferase;gene identification;bioinformatics analysis

2015-10-26

高斌(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：發酵工程，E-mail:82083790@qq.com。

付桂明(1972-)，男，博士，教授，研究方向：食品科學、發酵工程研究,E-mail:fuguiming@ncu.edu.cn。

食品與技術國家重點實驗室自由探索課題(SKLF-22B-201313)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0220-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.035