烘烤對核桃蛋白二級結(jié)構(gòu)、表面疏水性及乳化性的影響

趙潤澤,蔣　將,李進偉,劉元法

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

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烘烤對核桃蛋白二級結(jié)構(gòu)、表面疏水性及乳化性的影響

趙潤澤,蔣將,李進偉,劉元法*

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

研究了烘烤增香過程對核桃蛋白的二級結(jié)構(gòu)、表面疏水性以及乳化性的影響,采用掃描電鏡、圓二色譜等儀器進行分析。結(jié)果表明,烘烤處理的蛋白微結(jié)構(gòu)成片狀,α-螺旋結(jié)構(gòu)從42.7%降低至27.6%,β-轉(zhuǎn)角從17.3%增加到25.3%,無規(guī)則卷曲從24.7%增加到32.7%,β折疊比例不變。界面張力從20.98減少為18.49,表面疏水性從316.14降低為297.55。使用turbiscan多重光散射儀對蛋白與三種植物油形成的乳化液進行分析,其中烘烤處理的蛋白與花生油形成乳化液穩(wěn)定性指數(shù)為15.98,與大豆油形成的乳化液穩(wěn)定性指數(shù)為14.53,與葵花籽油形成的乳化液穩(wěn)定性指數(shù)為14.55,相比較于未處理蛋白形成的乳化液穩(wěn)定性均顯著下降。

核桃蛋白,烘烤,二級結(jié)構(gòu),表面疏水性,乳化穩(wěn)定性

核桃(JuglansregiaL.)是一種營養(yǎng)豐富、具有經(jīng)濟開發(fā)潛力的堅果。核桃除了可直接食用外,還可加工成核桃油、核桃粉等產(chǎn)品。其中核桃仁蛋白質(zhì)含量在13%～20%[1],其氨基酸種類高達18種,且谷氨酸含量最高。據(jù)報道,180 ℃烘烤20 min后的花生蛋白相比于未烘烤的花生蛋白的乳化穩(wěn)定性有顯著提高[2]。此外,大豆蛋白在90 ℃和100 ℃條件下熱處理15 min后乳化性迅速升高,乳化穩(wěn)定性有顯著改善,100 ℃處理30 min乳化穩(wěn)定性達到最大值[3]。工業(yè)上為核桃油增香多采用烘烤方法,溫度在130 ℃左右,但國內(nèi)對增香核桃油生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物核桃粕及其烘烤后性質(zhì)的研究較少。

目前對乳化穩(wěn)定性分析以觀察分層高度和比較吸光值變化為主[4-5]。但是這兩種方法檢測精確度較低,不能采用定量方法來評價體系的穩(wěn)定情況。利用近紅外發(fā)射光譜的背散射光穩(wěn)定性動力學(xué)參數(shù)(Stability Index)來研究乳化液的穩(wěn)定性已經(jīng)成為一種趨勢[6]。

本文采取烘烤對核桃蛋白進行處理,對處理后的表面性狀、二級結(jié)構(gòu)、表面張力、表面疏水性進行測定,最后采用turbiscan穩(wěn)定性分析儀分析核桃蛋白與不同脂肪酸組成的植物油形成的乳化液的性質(zhì),并對乳化液2 h內(nèi)的變化情況做動態(tài)分析。研究核桃油加工后的核桃蛋白性質(zhì),旨在對核桃資源進行綜合利用,提升核桃產(chǎn)品的附加值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

核桃(JuglansregiaL.)購于無錫農(nóng)貿(mào)市場;大豆油、玉米油、花生油購于歐尚超市;乙醇、正己烷、氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純。

90-1恒溫磁力攪拌器上海滬西分析儀器廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋常州金壇化學(xué)儀器廠;TGL-16B高速臺式離心機上海安亭科學(xué)儀器廠;UV2100紫外可見分光光度計優(yōu)尼科中國(上海)公司;PHS-3C pH計上海上海精密科學(xué)有限公司;OCA15EC接觸角測量儀德國德菲儀器股份有限公司;Quanta-200掃描電子顯微鏡荷蘭FEI公司;MOS-450圓二色光譜儀法國Bio-Logic比奧羅杰公司;turbiscan Lab多重光散射儀法國formulaction公司。

1.2實驗方法

1.2.1原料制備

1.2.1.1核桃蛋白制備參照杜蕾蕾[7]等人方法,將去皮核桃仁烘干后粉碎,按照1∶5的料液比進行脫脂處理1 h,用濾紙過濾提取液,收集殘渣,將殘渣再次進行正己烷處理,直到濾液為無色為止。收集殘渣放入通風(fēng)櫥揮干溶劑備用。

1.2.1.2烘烤核桃蛋白制備參照徐月華[8]等人方法,將核桃放入烘箱130 ℃烘烤30 min,然后取出。將核桃仁烘干后粉碎,按照1∶5的料液比進行脫脂處理1 h,用濾紙過濾提取液,收集殘渣,將殘渣再次進行正己烷處理,直到濾液為無色為止。收集殘渣放入通風(fēng)櫥揮干溶劑備用。

1.2.2堿溶酸沉提取蛋白流程脫脂粉→加水溶解(料液比1∶60)調(diào)整pH為11→攪拌1 h→離心(10000 r/min,20 min,4 ℃)→上清液→調(diào)整pH為4.5→攪拌1 h→離心(10000 r/min,20 min,4 ℃)→沉淀→水洗至中性→凍干→得到純度為94.8%的核桃蛋白和91.2%的烘烤核桃蛋白。

1.2.3掃描電鏡觀察參照張海華[9]等人方法,將處理過的核桃蛋白樣品在干燥器保存15 d后,取少量樣品過100 目篩,將篩過的樣品用1%的OsO4固定1 h,以SCD-005離子濺射儀噴金,最后用掃描電子顯微鏡拍照。

1.2.4二級結(jié)構(gòu)測定參照Sreerama[10]等人方法,樣品溶于去離子水中,在25 ℃條件下磁力攪拌3 h,之后在4 ℃以10000×g離心45 min,上清液中蛋白濃度采用BCA試劑盒測定,最后將上清液蛋白濃度稀釋至50 μg/mL。在25 ℃條件下,采用MOS-450圓二色光譜儀測定樣品得到遠紫外CD光譜(190～250 nm)。空白采用去離子水,用平均摩爾橢圓率[θ](deg cm2·dmol-1)表示。

1.2.5蛋白表面張力測定參照Azioune[11]等人方法,將蛋白質(zhì)溶于水中,用pH7的磷酸緩沖鹽溶液制成0.1%蛋白質(zhì)溶液。在20 ℃的條件下,使用OCA15EC接觸角測量儀以50 μL/s速度將蛋白質(zhì)溶液注入大豆油中,在溶液液滴完整掉落時測定油水界面張力。

1.2.6蛋白表面疏水性測定參照Kato[12]等人的方法,配制2%的蛋白溶液,用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)將其分別稀釋至0.5、0.25、0.1、0.05、0.02、0.005 mg/mL。取4 mL稀釋液,加入50 μL的ANS溶液后,用熒光分光光度計在365 nm的激發(fā)波長和484 nm的發(fā)射波長下測定樣品的熒光強度,以熒光強度對蛋白質(zhì)濃度作圖,外推至蛋白質(zhì)濃度為0,曲線斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。

1.2.7蛋白乳化穩(wěn)定性

1.2.7.1乳化液的制備將質(zhì)量百分比1%核桃蛋白溶液和10%植物油用高速剪切機在13500 r/min轉(zhuǎn)速下剪切2 min,再將乳狀液用高壓均質(zhì)機在40 MPa壓力下均質(zhì)兩次

1.2.7.2乳化穩(wěn)定性測量將乳液加至樣品瓶中刻度線位置,放入turbiscan Lab多重光散射儀中,使用近紅外光(λ=880 nm)從樣品瓶底部開始掃描,經(jīng)中部到頂部掃描一次。設(shè)置掃描間隔30 s,掃描時長2 h,溫度30 ℃。得到不同時間乳化液背散射光強度曲線圖,根據(jù)計算機軟件計算穩(wěn)定性指數(shù)(Stability Index)。穩(wěn)定性指數(shù)(Stability Index)由turbiscan軟件基于從樣品瓶底部到頂部共41 mm高度,共2 h時間內(nèi)背散射光數(shù)據(jù)變化自動計算,數(shù)值越低表明乳化液穩(wěn)定性越好[13]。

1.2.8分析方法所有實驗進行3次平行實驗,利用SPSS Statistics 18.0軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。采用Tukey’s檢驗進行顯著性分析。

2　結(jié)果與討論

2.1掃描電鏡觀察

通過掃描電鏡(SEM)觀察蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)如圖1所示。可以觀察到烘烤工藝對核桃蛋白微結(jié)構(gòu)的影響。未處理蛋白顯示出比較稀松的結(jié)構(gòu),烘烤后蛋白呈現(xiàn)片狀結(jié)構(gòu)。當?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)加熱處理后,其高級結(jié)構(gòu)會發(fā)生去折疊,為避免暴露出疏水基團,蛋白質(zhì)分子間會發(fā)生疏水聚集引發(fā)表面結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化[14]。有研究表明,蛋白質(zhì)微結(jié)構(gòu)不同,對物理化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能性會產(chǎn)生一定影響。其中稀松狀結(jié)構(gòu)蛋白體積密度相比于片狀結(jié)構(gòu)較小,有助于提高溶解性和乳化穩(wěn)定性。

圖1　掃描電鏡觀察圖片F(xiàn)ig.1　SEM picture of walnut protein

2.2二級結(jié)構(gòu)測定

表1　核桃蛋白CD光譜二級結(jié)構(gòu)分析

注:不同組之間字母不相同者表示組間顯著性差異,p<0.05;表2同。

核桃蛋白CD光譜二級結(jié)構(gòu)分析如表1所示。通過軟件分析得到,核桃蛋白主要以α-螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲為主,分別占42.7%和24.7%。通過烘烤后,在制備過程中改變了核桃蛋白的二級結(jié)構(gòu),在一定程度上破壞了α-螺旋結(jié)構(gòu),使得無規(guī)則卷曲有所上升。可以推斷烘烤處理后破壞了蛋白質(zhì)分子的氫鍵,使得α-螺旋結(jié)構(gòu)減少,β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)大量增加,從而增大蛋白質(zhì)分子的柔性,對乳化穩(wěn)定性有明顯影響。

2.3界面張力

核桃蛋白界面張力變化如表2所示。相比未處理蛋白,經(jīng)過烘烤處理后蛋白質(zhì)的界面張力有一定變化,根據(jù)研究結(jié)果表明,界面張力下降源于聚集體變化,高級結(jié)構(gòu)展開使蛋白界面上親水基團和疏水基團數(shù)量趨于平衡。通過改性,有助于形成較為穩(wěn)定的乳化液。

表2　核桃蛋白表面疏水性和油水界面張力

2.4表面疏水性

蛋白質(zhì)一般在分子內(nèi)部形成疏水內(nèi)核為非極性氨基酸側(cè)鏈,在表面的親水環(huán)境中分布的為極性氨基酸。表面疏水性比整體的疏水性而言影響著蛋白質(zhì)分子間的相互作用,對蛋白質(zhì)功能性有影響。表面疏水性如表2所示,烘烤處理蛋白質(zhì)(297.55)表面疏水性相比要未處理蛋白(316.14)略有降低,可見在制備過程中疏水相互作用引起的亞基之間相互聚合,導(dǎo)致疏水性下降。可見烘烤處理在一定程度上降低了表面疏水性。一般情況下,表面疏水性降低不利于提高乳狀液穩(wěn)定性[15]。

2.5乳化穩(wěn)定性

圖2～圖9為乳化穩(wěn)定性變化分析結(jié)果。背散射光數(shù)據(jù)是從底部到液面頂部共41 mm掃描結(jié)果。兩條曲線代表起始兩個時間點對整個樣品瓶共41 mm的背散射光數(shù)據(jù)。背散射光強下降,說明該位置乳化液油滴濃度下降,背散射光強上升,說明該位置乳化液油滴濃度上升,背散射光強不變,說明該位置乳化液油滴濃度保持不變。

圖2　未處理蛋白與花生油形成乳化液背散射光分析Fig.2　Back scattered light of untreatedwalnut protein with peanut oil emulsion

圖3　未處理蛋白與大豆油形成乳化液背散射光分析Fig.3　Back scattered light of untreatedwalnut protein with soybean oil emulsion

圖4　未處理蛋白與葵花籽油形成乳化液背散射光分析Fig.4　Back scattered light of untreatedwalnut protein with sunflower oil emulsion

由圖2～圖4可見,未處理蛋白與花生油、葵花籽油形成的乳化液在底部0～5 mm處有油滴濃度下降,在頂部35～41 mm處有油滴濃度上升,在中間油滴濃度保持相對穩(wěn)定;未處理蛋白與大豆油形成的乳化液有劇烈分層現(xiàn)象,在位置24 mm左右有明顯油滴濃度分界線,在24 mm以下油滴濃度下降劇烈,相比較于0 h時間點背散射光下降達到10%,在24 mm以上油滴濃度上升,相比較于0 h背散射光上升達到6%。

由圖5～圖7可見,烘烤蛋白與三種油形成的乳化液均有分層現(xiàn)象。其中烘烤蛋白與花生油、葵花籽油形成的乳化液,在20 mm附近有明顯油滴濃度分界線,在20 mm以下,相比較于0 h時間點背散射光下降均超過30%;與大豆油形成乳化液在17 mm有油滴濃度分界線,但是背散射光下降最大值也達到30%。

圖5　烘烤蛋白與花生油形成乳化液背散射光分析Fig.5　Back scattered light of heated walnut protein with peanut oil emulsion

圖6　烘烤蛋白與大豆油形成乳化液背散射光分析Fig.6　Back scattered light of heated walnut protein with soybean oil emulsion

圖7　烘烤蛋白與葵花籽油形成乳化液背散射光分析Fig.7　Back scattered light of heated walnut protein with sunflower oil emulsion

由圖8和圖9可見,未處理蛋白與三種植物油形成的乳化液均比烘烤處理蛋白與三種植物油形成的乳化液穩(wěn)定,所有乳化液均隨著時間變化穩(wěn)定性逐漸降低。

圖8　未處理蛋白與三種油形成乳化液穩(wěn)定性分析Fig.8　The curves of emulsion stability of untreated walnut protein different oil

圖9　烘烤蛋白與三種油形成乳化液穩(wěn)定性分析Fig.9　The curves of emulsion stability of heated walnut protein different oil

未處理蛋白與三種植物油形成的乳化液中,與大豆油形成的乳化液在前30 min穩(wěn)定性指數(shù)呈直線上升趨勢,最終穩(wěn)定性指數(shù)達到7.5,相比其他兩種乳化液,與大豆油形成的乳化液最不穩(wěn)定。烘烤蛋白與三種植物油形成的乳化液穩(wěn)定性有很大下降,三種乳化液穩(wěn)定性指數(shù)在40 min前迅速上升,在2 h時均超過13。背散射光強與穩(wěn)定性指數(shù)呈正比例變化,背散射光強變化越大,穩(wěn)定性指數(shù)越大,與文獻報道一致[16]。烘烤處理的蛋白與花生油形成乳化液穩(wěn)定性指數(shù)為15.98,與大豆油形成的乳化液測量終點穩(wěn)定性指數(shù)為14.53,與葵花籽油形成的乳化液測量終點穩(wěn)定性指數(shù)為14.55。

不同植物油對乳化液的穩(wěn)定性有顯著影響,有研究表明,植物油的種類對乳化液穩(wěn)定性有顯著影響[16]。可能是與不飽和脂肪酸的結(jié)構(gòu)有關(guān),不飽和脂肪酸不飽和程度越高,蛋白質(zhì)氨基酸的疏水部分能夠更好的與油滴表面結(jié)合形成穩(wěn)定的界面膜[17]。實驗選用的植物油脂肪酸組成如表3所示。未處理蛋白與葵花籽油、大豆油形成的乳化液相對穩(wěn)定,大豆油乳化液最不穩(wěn)定。烘烤處理蛋白與三種植物油形成的乳化液相比于未處理蛋白與三種植物油形成的乳化液不穩(wěn)定程度增加,并且有明顯的油滴濃度分界線。可能原因是烘烤后微結(jié)構(gòu)成片狀,亞基聚合,溶解性和乳化性下降,所以引起乳化液穩(wěn)定性下降。

表3　植物油脂肪酸組成(%)

3　結(jié)論

烘烤對核桃蛋白的微結(jié)構(gòu)有較大影響,烘烤核桃蛋白微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)片狀,二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)減少,β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)大量增加,界面張力也有所下降,烘烤對核桃蛋白表面疏水性影響變化不明顯。不同植物油對乳化液穩(wěn)定性有顯著影響,未處理蛋白與葵花籽油、花生油形成的乳化液相對穩(wěn)定。烘烤處理蛋白與三種植物油穩(wěn)定性均很差,沒有明顯差別。其中烘烤處理的蛋白與花生油形成乳化液穩(wěn)定性指數(shù)為15.98,與大豆油形成的乳化液穩(wěn)定性指數(shù)為14.53,與葵花籽油形成的乳化液穩(wěn)定性指數(shù)為14.55。

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Influence of roast processing on secondary structure,surface hydrophobicity and emulsifying properties of walnut protein

ZHAO Run-ze,JIANG Jiang,LI Jin-wei,LIU Yuan-fa*

(School of Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The properties of roasted walnut proteins were investigated in this study. The micro-structure observed by SEM were turned from vesicular to flaky. The amount ofα-helix conformation of roasted protein was reduced from 42.7% to 27.6%,the amount ofβ-turn was increased from 17.3% to 25.3%,the amount of random coil was increased from 24.7% to 32.7%,the amount ofβ-pleated sheet was not changed. The interfacial tension was declined from 20.98 to 18.49,the surface hydrophobicity was declined from 316.14 to 297.55.Three kinds of vegetable oil and toasted protein were emulsified. The stability index of peanut oil was 15.98,the soybean oil was 14.53,the sunflower seed oil was 14.55.

walnut protein;roasted;secondary structure;surface hydrophobicity;emulsifying properties

2016-01-22

趙潤澤(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：油脂與植物蛋白，E-mail:peter1989046@sina.com。

劉元法(1974-)，男，博士，教授，研究方向：油脂營養(yǎng)與安全，E-mail:yfliu@jiangnan.edu.cn。

高油高蛋白油料水酶法制油(2013AA102103-1)；糧食公益性行業(yè)科研專項(201313011-7-3)。

TS225.1

A

1002-0306(2016)16-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.023