鈣離子通道抑制劑處理下發(fā)芽大豆主要生理生化和γ-氨基丁酸的代謝變化

尹永祺,李　童,王淑雯，史穎悟,高　璐,饒勝其,楊振泉,方維明

(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225127)

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鈣離子通道抑制劑處理下發(fā)芽大豆主要生理生化和γ-氨基丁酸的代謝變化

尹永祺,李童,王淑雯，史穎悟,高璐,饒勝其,楊振泉,方維明*

(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225127)

為研究鈣離子通道抑制劑對NaCl脅迫下發(fā)芽大豆生理代謝和γ-氨基丁酸(GABA)富集的影響,通過NaCl聯(lián)合質(zhì)膜鈣離子通道抑制劑(LaCl3)和內(nèi)膜鈣離子通道抑制劑(Heparin)處理大豆籽粒,分析發(fā)芽期間主要生理生化和GABA代謝酶活力的變化。結(jié)果顯示,發(fā)芽大豆經(jīng)NaCl聯(lián)合LaCl3處理后,其生長發(fā)育較單獨(dú)NaCl處理進(jìn)一步受到抑制,芽長顯著降低,經(jīng)Heparin處理芽長無顯著性變化,而二者呼吸速率均顯著增加。相較單獨(dú)NaCl處理,NaCl聯(lián)合LaCl3或Heparin處理后其子葉中GABA代謝酶活力均顯著下降,LaCl3處理后子葉和胚中GABA含量分別為NaCl處理的50%和79%,而Heparin處理則分別為70%和66%,表明抑制內(nèi)源鈣庫的釋放對NaCl脅迫下GABA富集的影響小于抑制質(zhì)膜鈣離子通道。

發(fā)芽大豆,γ-氨基丁酸,NaCl脅迫,鈣離子通道抑制劑

γ-氨基丁酸(GABA)于2009年被中國衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品,其屬于非蛋白質(zhì)氨基酸,作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用,具有改善大腦血液循環(huán)、促進(jìn)腦組織新陳代謝、改善神經(jīng)機(jī)能、降血氨、抗驚厥、降血壓以及恢復(fù)腦細(xì)胞等多種生理功能[1-3]。

研究發(fā)現(xiàn),植物籽粒發(fā)芽期間,尤其在鹽脅迫[4]和低氧[5]等非生物脅迫下發(fā)芽,其GABA含量數(shù)以倍計(jì)的提高。因此,植物籽粒在逆境條件下發(fā)芽累積GABA受到國內(nèi)外功能食品研究者的高度關(guān)注。然而,植物籽粒在脅迫條件下發(fā)芽其生長同樣受到嚴(yán)重抑制,導(dǎo)致其生物產(chǎn)量下降[6]。據(jù)報(bào)道,鹽脅迫下的發(fā)芽大豆施用CaCl2后可恢復(fù)正常生長,且仍能大量累積GABA[7]。據(jù)此,推測外源Ca2+可緩解逆境脅迫對植物生長的抑制作用并促進(jìn)GABA累積,但其作用機(jī)制尚不明確。植物細(xì)胞受到外界信號刺激時,其既可通過質(zhì)膜鈣離子通道釋放胞外鈣庫,亦可利用細(xì)胞內(nèi)膜上的鈣通道使鈣離子從胞內(nèi)鈣庫進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),促使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子含量升高,其后細(xì)胞質(zhì)中的CaM與鈣離子結(jié)合并激活相應(yīng)靶酶或靶蛋白,從而導(dǎo)致細(xì)胞生理生化反應(yīng)[8-9]。因此,為探討鈣離子通道在發(fā)芽大豆生長及累積GABA中發(fā)揮的作用,本研究分析質(zhì)膜鈣離子通道抑制劑(LaCl3)和內(nèi)膜離子通道抑制劑(Heparin)處理對NaCl脅迫下發(fā)芽大豆生長狀況、生化代謝的影響,并研究其對發(fā)芽大豆子葉和胚中GABA含量以及GABA合成酶活性的調(diào)控作用,以期初步揭示鈣離子通道介導(dǎo)NaCl脅迫下發(fā)芽大豆生理生化及GABA代謝的作用機(jī)理。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大豆(GlycinemaxL. Merr)籽粒購于2015年,產(chǎn)自中國東北吉林省,封裝于密閉容器中,4 ℃保存?zhèn)溆?GABA標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司;乙腈色譜純;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

Agilent 1200 Series高效液相色譜儀Agilent公司;UV-7504C型紫外可見分光光度計(jì)上海欣茂儀器有限公司;BCD-257SL型冰箱青島海爾股份有限公司;PHS-3C pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司;ZXDP-A2080電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海智誠有限公司;高速冷凍離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品制備稱取20 g籽粒飽滿的大豆,經(jīng)去離子水沖洗后置于1%(v/v)次氯酸鈉水溶液中浸泡消毒15 min,消毒大豆用去離子水沖洗至pH中性后于30 ℃浸泡4 h;將浸泡后大豆置于發(fā)芽機(jī)于30 ℃避光發(fā)芽,分別設(shè)以下處理并進(jìn)行發(fā)芽:對照(去離子水);NaCl脅迫處理(50 mmol/L NaCl);NaCl脅迫加LaCl3處理(50 mmol/L NaCl+5 mmol/L LaCl3);NaCl脅迫加Heparin處理(50 mmol/L NaCl+5 mmol/L Heparin);發(fā)芽4 d期間,每隔1 d更換培養(yǎng)液至培養(yǎng)結(jié)束,期間定時取樣測定相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2指標(biāo)測定與方法

1.2.2.1芽長隨機(jī)選取30粒發(fā)芽大豆,用游標(biāo)卡尺測定其芽長。

1.2.2.2呼吸速率參照小籃子法[10]測定。

1.2.2.3脯氨酸含量取樣品0.5 g于試管中,加入5 mL 3%磺基水楊酸,經(jīng)沸水浴提取10 min,期間不斷晃動;吸取2 mL提取液于另一具塞試管,加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮,混勻后沸水浴30 min,冷卻后加入4 mL甲苯搖蕩30 s,靜置取上清液至10 mL離心管于3000 g離心5 min,取離心后上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色皿中,以甲苯為空白于520 nm處測定其光密度值[10]。

1.2.2.4谷氨酸脫羧酶(GAD)活性參照Zhang等[11]方法進(jìn)行測定。

1.2.2.5氨基醛脫氫酶(AMADH)活性稱取1 g發(fā)芽大豆,加入預(yù)冷酶提取液1∶2(w/v):0.1 mol/L pH8.0 磷酸鉀緩沖液,5 mmol/L DTT,1 mmol/L EDTA,10%(w/v)蔗糖,12000×g離心30 min,上清液即為粗酶液;取適量酶液加入0.1 mol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液,內(nèi)含1 mmol/L NAD+,加入終體積為1 mmol/L的4-氨基丁醛啟動反應(yīng),37 ℃于340 nm處連續(xù)測定吸光值,以每分鐘OD340 nm變化0.01個單位為1個酶活力單位(U)[12]。

1.2.2.6GABA含量參照Bai等[13]方法進(jìn)行測定。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件18.0(SPSS,18.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,均值間比較采用Tukey多重比較,在0.05水平上進(jìn)行顯著檢驗(yàn)(p<0.05)。

2　結(jié)果與分析

2.1鈣離子通道抑制劑對發(fā)芽大豆主要生理生化指標(biāo)的影響

2.1.1形態(tài)特征圖1直觀顯示發(fā)芽大豆經(jīng)NaCl及其聯(lián)合鈣離子通道抑制劑處理后,其生長狀態(tài)明顯受到影響,其中經(jīng)NaCl聯(lián)合LaCl3處理的發(fā)芽大豆受抑制情況更嚴(yán)重,表觀上可看出發(fā)芽4 d時,Heparin處理組的生長較單獨(dú)NaCl處理組無明顯差異。

圖1　鈣離子通道抑制劑對發(fā)芽大豆形態(tài)的影響Fig.1　Effect of calcium channel inhibitor treatment on morphology of germinating soybean注:CK:對照;N:NaCl;NL:NaCl+LaCl3;NH:NaCl+Heparin,圖2～圖7同。

2.1.2芽長由圖2可看出,發(fā)芽期間各處理下的發(fā)芽大豆芽長均隨發(fā)芽時間延長呈增加趨勢,發(fā)芽4 d后各處理間芽長具有顯著差異(p<0.05)。NaCl聯(lián)合LaCl3處理的芽長顯著低于對照處理與NaCl處理,發(fā)芽4 d時其芽長分別為對照組和NaCl處理組的30%和51%;相對而言,發(fā)芽4 d經(jīng)NaCl聯(lián)合Heparin處理的豆芽與NaCl無顯著差異;NaCl聯(lián)合LaCl3處理組對芽長起到的抑制作用顯著高于NaCl聯(lián)合Heparin處理組。

圖2　鈣離子通道抑制劑對發(fā)芽大豆芽長的影響Fig.2　Changes in sprout length of germinating soybeanunder calcium channel inhibitor treatments注:圖中字母表示顯著性檢驗(yàn)結(jié)果,不同小寫字母表示不同處理間差異達(dá)顯著水平(p<0.05)；圖3～圖7同。

2.1.3呼吸速率發(fā)芽期間各處理的豆芽呼吸速率均呈增長狀態(tài),NaCl脅迫下,各處理的豆芽呼吸速率都受到了抑制(圖3),發(fā)芽4 d后,NaCl聯(lián)合鈣離子通道抑制劑處理組的呼吸速率均顯著高于單獨(dú)NaCl處理。前期(發(fā)芽2 d)NaCl聯(lián)合Heparin處理的豆芽呼吸速率受抑制作用較小,其與對照并無顯著性差異。兩種鈣通道抑制劑在發(fā)芽期間對發(fā)芽大豆的影響不同,這可能是因?yàn)閮煞N鈣離子通道的作用機(jī)制不同造成的差異,LaCl3可結(jié)合質(zhì)膜Ca2+泵上的Mg2+催化位點(diǎn),抑制Ca2+泵作用進(jìn)而阻礙Ca2+跨膜運(yùn)輸,而Heparin抑制細(xì)胞內(nèi)膜上的鈣釋放通道,致使產(chǎn)生的鈣信號強(qiáng)度不同,發(fā)芽大豆的生理狀態(tài)產(chǎn)生差異[9,14]。

圖3　鈣離子通道抑制劑處理下發(fā)芽大豆呼吸速率的變化Fig.3　Changes in respiratory rate of germinating soybean under calcium channel inhibitor treatments

2.1.4脯氨酸含量發(fā)芽期間各處理下發(fā)芽大豆中脯氨酸含量均呈增加趨勢(圖4)。NaCl脅迫導(dǎo)致發(fā)芽大豆子葉中脯氨酸含量顯著增加,發(fā)芽4 d時其子葉中含量為對照的2倍,而胚中卻顯著下降;經(jīng)NaCl聯(lián)合LaCl3處理后其子葉中含量較NaCl脅迫無顯著變化,胚中則顯著增加。NaCl聯(lián)合Heparin處理4 d后其子葉和胚中脯氨酸含量均顯著低于NaCl及其聯(lián)合LaCl3處理。目前學(xué)界對于脯氨酸在植物中所發(fā)揮的作用有著不同的觀點(diǎn),低溫、低氧和干旱等非生物脅迫均能引起植物中脯氨酸含量顯著增加,鹽脅迫下煙草、擬南芥、大豆和番茄等多種植物亦顯著積累脯氨酸并提高了其抗脅迫能力,表明脯氨酸的積累可增加植物對滲透脅迫的耐受性[15];然而,亦有研究認(rèn)為脯氨酸是植物傷害性指標(biāo),與植物抗脅迫并無相關(guān)性[16],研究發(fā)現(xiàn)一些高粱屬植物[17]和大豆[18]經(jīng)脅迫處理,其脯氨酸含量顯著增加并未提高植物的耐鹽能力。本研究中,NaCl脅迫下,大豆在發(fā)芽期間子葉中脯氨酸含量顯著高于對照,而胚中其含量顯著降低,表明脯氨酸累積量與植物的器官類型有關(guān)。而Ca2+通道對于脯氨酸的調(diào)控影響可能從側(cè)面證實(shí)脯氨酸只是植物傷害性指標(biāo),與植物抗脅迫并無直接相關(guān)性。

圖4　鈣離子通道抑制劑對發(fā)芽大豆游離脯氨酸含量的影響Fig.4　Effect of calcium channel inhibitor on proline content of germinating soybean

2.2鈣離子通道抑制劑對發(fā)芽大豆GABA富集的影響

2.2.1GAD活性在植物中,GABA代謝包括GABA支路和多胺降解兩條途徑,GABA支路中GAD將谷氨酸直接脫羧生成GABA,因此GAD是GABA支路的限速酶[19]。由圖5可看出,單純經(jīng)NaCl脅迫處理的發(fā)芽大豆子葉和胚中GAD活力顯著高于對照。4 d發(fā)芽大豆經(jīng)NaCl聯(lián)合LaCl3或Heparin處理,其子葉中GAD活力均顯著低于單純經(jīng)NaCl處理(p<0.05),胚中聯(lián)合LaCl3處理組顯著下降,而聯(lián)合Heparin處理組則與NaCl處理無顯著差異。這可能是由于植物GAD中存有鈣調(diào)素結(jié)合域,其活性受到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的影響,Matsumoto等利用Ca2+通道激活劑提高了蘆筍細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,進(jìn)而提高GAD活力,因此,施用Ca2+通道抑制劑后導(dǎo)致了GAD活力下降,然而不同抑制劑對于GAD活力影響具有差異。

圖5　鈣離子通道抑制劑處理下發(fā)芽大豆GAD活性的變化Fig.5　Changes in GAD activity of germinating soybeanunder calcium channel inhibitor treatment

2.2.2AMADH活性AMADH是多胺降解途徑中的限速酶,其可將多胺經(jīng)胺氧化酶氧化產(chǎn)生的4-氨基丁醛脫氫生成GABA[20]。由圖6可知,發(fā)芽期間各處理下發(fā)芽大豆AMADH活力變化趨勢具有顯著差異。NaCl脅迫處理4 d顯著提高了大豆子葉中AMADH活力(p<0.05),其活力為對照的1.38倍,而胚中則無顯著變化(p>0.05)。發(fā)芽4 d后,經(jīng)NaCl聯(lián)合LaCl3或Heparin處理發(fā)芽大豆子葉中AMADH活力較NaCl處理組顯著下降,胚中LaCl3組則顯著低于NaCl及其聯(lián)合Heparin處理組。

圖6　鈣離子通道抑制劑處理下發(fā)芽大豆AMADH活性變化Fig.6　Changes in AMADH activity of germinating soybeanunder calcium channel inhibitor treatment

2.2.3GABA含量圖7顯示各處理下發(fā)芽大豆子葉和胚中GABA含量都隨發(fā)芽時間顯著增加(p<0.05)。發(fā)芽4 d,單純經(jīng)NaCl處理的大豆子葉和胚中GABA含量顯著高于對照,子葉中為對照的1.61倍,胚中則為1.87倍。NaCl聯(lián)合LaCl3或Heparin處理后GABA含量與對照相比差異不顯著,但均顯著低于單純經(jīng)NaCl處理,這是由于GABA合成兩途徑中的限速酶GAD和AMADH的活力受到Ca2+通道抑制劑的影響(圖5和圖6)。發(fā)芽4 d時，NaCl聯(lián)合LaCl3處理后,子葉和胚中GABA含量分別為NaCl處理的50%和79%,NaCl聯(lián)合Heparin處理則分別為70%和66%,表明Ca2+通道參與調(diào)控植物中GABA代謝,且抑制內(nèi)源鈣庫的釋放對NaCl脅迫下GABA富集的影響小于抑制質(zhì)膜鈣離子通道。

圖7　鈣離子通道抑制劑處理下發(fā)芽大豆GABA含量的變化Fig.7　Changes in GABA expression in germinating soybeanunder calcium channel inhibitor treatment

3　結(jié)論

相較單獨(dú)NaCl處理,大豆籽粒發(fā)芽4 d期間經(jīng)NaCl聯(lián)合LaCl3(質(zhì)膜鈣離子通道抑制劑)處理,發(fā)芽大豆的芽長顯著下降,發(fā)芽大豆生長受到進(jìn)一步抑制,同時,鈣離子通道抑制劑顯著抑制了發(fā)芽大豆各部位脯氨酸含量;施用兩種鈣離子通道抑制劑均顯著降低了發(fā)芽大豆子葉中GAD和AMADH活力,而胚中GABA代謝限速酶活力變化趨勢不一致,且相較聯(lián)合Heparin處理,聯(lián)合LaCl3處理對GABA代謝限速酶活力影響較大,進(jìn)而阻礙發(fā)芽大豆中GABA累積,但抑制效果存在差異,內(nèi)源鈣庫的釋放對NaCl脅迫下GABA富集的影響小于質(zhì)膜鈣離子通道。

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Physiological change and the regulation of γ-aminobutyric acid accumulation in germinated soybean under inhibitors of calcium channel treatment

YIN Yong-qi,LI Tong,WANG Shu-wen,SHI Ying-wu,GAO Lu,RAO Sheng-qi,YANG Zhen-quan,FANG Wei-ming*

(College of Food Science and Engineering,Yangzhou University,Yangzhou 225127,China)

The effect of membrane calcium channel inhibitor(LaCl3)and endometrium calcium channel inhibitor(Heparin)on the main physiological metabolism and γ-aminobutyric acid(GABA)accumulation in soybeans during germination under NaCl stress were investigated. Under NaCl combining LaCl3treatment,the growth of germinating soybeans was further suppressed,the sprout length decreased significantly,while no significant change was observed under heparin treatment. However,the respiratory rate both increased significantly under LaCl3and heparin treatment. Compared with NaCl treatment,rate-limiting enzyme activities of GABA metabolism in cotyledon decreased significantly under NaCl plus LaCl3or heparin treatment. Under LaCl3treatment,GABA content was 50% and 79% of the NaCl treatment in cotyledon and embryo,respectively. However,under heparin treatment,GABA content in cotyledon and embryo was 70% and 66% of the NaCl treatment,respectively. This result indicates that the inhibit effect of endogenous calcium stores on GABA content was smaller than membrane calcium channel.

germinated soybean;γ-aminobutyric acid;NaCl stress;inhibitor of calcium channel

2016-01-15

尹永祺(1988-)，男，博士，講師，研究方向：植物功能物質(zhì)富集機(jī)理及技術(shù)，E-mail：yqyin@yzu.edu.cn。

方維明(1965-)，男，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏，E-mail：wmfang@yzu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31501401)；江蘇省自然科學(xué)基金青年基金(BK20150448)；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目資助(15KJB550010);江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(SJLX16_0901)。

TS210.1

A

1002-0306(2016)16-0122-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.016