云南瑪咖中功能性成分的分析研究

杜　萍,楊　敏,朱艷琴,黃紹軍,賀與平,劉潤民

(昆明理工大學分析測試研究中心,云南昆明 650093)

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云南瑪咖中功能性成分的分析研究

杜萍,楊敏,朱艷琴,黃紹軍,賀與平,劉潤民

(昆明理工大學分析測試研究中心,云南昆明 650093)

研究云南栽培瑪咖(LepidiummeyeniiWalpers)的功能性成分。采用經典的植物化學研究方法硅膠色譜柱法對云南瑪咖進行分離純化,通過紅外光譜、核磁共振光譜、質譜及色譜的相關數據及結合文獻進行分析研究。從瑪咖中分離鑒定了3個化合物,分別為β-谷甾醇(β-sitosterol)、n-芐基十六烷酰胺(N-benzylhexadecanamide)、蔗糖(Sucrose);從瑪咖提取物中分析確定含有5個瑪咖酰胺、2個咪唑生物堿和2個芥子油苷化合物。

瑪咖,n-芐基十六烷酰胺,β-谷甾醇,蔗糖,瑪咖酰胺,咪唑生物堿,芥子油苷

瑪咖為十字花科(Cruciferae)獨行菜屬(Lepidium)植物,學名LepidiummeyeniiWalpers,一年生或兩年生草本。此植物原生長在秘魯海拔3500～4500 m的安第斯山區[1-2],屬于高海拔半野生植物,種植過程完全人工進行?，斂Ш胸S富的營養成分,國內主要報道有余龍江[3]對干粉的營養成分及抗疲勞作用研究,楊晶明[4]對瑪咖干品營養成分分析研究,杜萍[5]、孫曉東[6]、單云[7]對云南瑪咖營養成分及揮發性成分的研究等。

瑪咖具有強身健體、增強人體免疫力、提高生育力、快速恢復體力、抗疲勞等功效[8-9],因此自2002年引進到我國以來,已有10余年的歷史,90%以上種植區域在云南。對于秘魯原產地種植瑪咖的化學成分(次生代謝部分)自2000年以來國外已有相應的報道,主要集中在瑪咖酰胺、瑪咖烯、芥子油苷、甾醇和酚類[10-13]等。有關云南栽培瑪咖的化學成分分離、分析方面的研究報道較少,而云南又為最大的種植區域,因此本文采取提取分離純化及多種分析技術,研究云南瑪咖的化學成分,為有效地評價云南瑪咖的營養功能價值,綜合利用云南瑪咖提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

瑪咖來自云南麗江玉龍縣人工栽培的瑪咖;薄層層析硅膠板(G板50 mm×150 mm)和柱層析硅膠(200～300目)青島海洋化工廠;乙醇、石油醚、乙酸乙酯、無水硫酸鈉、硫酸分析純,天津化學試劑公司;蔗糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖分析純,上海國藥試劑公司。

DFT-200手提式高速萬能粉碎機(功率:900 W、細度:50～200目、轉速25000 r/min)國產;AVANCE III-600 MHz超導核磁共振儀美國Bruker公司;AutoSpec Premier P776雙聚焦三扇型磁質譜儀美國Waters;TENSOR27傅立葉變換中紅外光譜儀美國Bruker公司;Agilent 1100 LC-MSD/TOF美國Agilent公司;Waters Xevo TQ-S超高壓液相色譜三重四極桿串聯質譜聯用儀美國Waters;U3000雙三元高效液相色譜儀(附蒸發光檢測器(ELSD)和變色龍軟件7.1色譜工作站)美國戴安公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品提取分離與分析

1.2.1.1活性成分的提取分離[13]瑪咖干燥根莖2 kg,粉碎至50目,用75%乙醇兩次回流提取,每次用乙醇5 L,每次回流2 h,濾出提取液后,物料再用50%乙醇回流提取兩次,每次用乙醇4 L,每次回流2 h,濾出提取液,將全部醇提取液合并,減壓濃縮成膏狀物約1.3 kg。

取上述瑪咖乙醇浸膏1 kg,加入1 L的蒸餾水,攪拌均勻得混懸液,置分液漏斗中,用石油醚(60～90 ℃)萃取3次,共得石油醚萃取液約4500 mL,將石油醚液濃縮至約1000 mL,加入無水硫酸鈉干燥,濾出,石油醚液再濃縮至干,得到石油醚提取物15 g。

取石油醚提取物,經硅膠(200～300目)柱(直徑100 mm×長度50 mm)減壓柱層析,以石油醚-乙酸乙酯進行梯度洗脫(8∶2～2∶8,v/v),按TLC指示合并流分(以250 mL一份收集洗脫液),獲得18個流分(Fr.1～Fr.18)。Fr.4～Fr.6流分合并濃縮后放置,析出結晶,用甲醇反復純化,得白色結晶85 mg,編號為MF(化合物A)。由上述Fr.7～Fr.9合并流分,經硅膠短柱(直徑100 mm×長度50 mm)進行減壓柱層析分離,以石油醚-乙酸乙酯進行梯度洗脫(95∶5～80∶20,v/v),按TLC指示合并流分(以200 mL一份收集洗脫液),獲得30個流分(Fr.1～Fr.30)。Fr.21～Fr.23流分合并,合并液減壓蒸干后,用甲醇處理,得黃白色粉狀物,經甲醇重結晶得白色結晶25 mg,編號為MI-B(化合物B)。

石油醚萃取過的混懸液置旋轉蒸發器中減壓蒸干至無水滴出現,加入無水乙醇800 mL,回流提取2 h,上清液放置過夜,傾出上清液,置冰箱冷藏層放置48 h,析出黃白色粒狀結晶,用少量甲醇洗滌結晶,得到白色粒狀結晶,編號MS(化合物C)。

1.2.1.2瑪咖活性部位的成分分析[14]稱取100 g瑪咖浸膏(70%乙醇提取),用無水乙醇400 mL分兩次溶解,于離心機中3000 r/min離心30 min。上清液轉入錐形瓶中,置冰箱冷藏層放置過夜。次日,上清液于50 ℃以下減壓濃縮至無乙醇味,加水100 mL攪拌均勻,轉入分液漏斗中,用2%氫氧化鈉調pH至9,再用氯仿萃取3次,合并氯仿萃取液,用無水硫酸鈉干燥后,減壓濃縮至干,所得提取物部分為總生物堿。此部分經超高壓液相色譜三重四極桿串聯質譜聯用儀檢驗,結合并依據相關文獻,分析鑒定其中主要成分。

上述氯仿萃取后的母液用2%鹽酸中和(最好操作在5 ℃以下進行),再用乙酸乙酯萃取三次,合并乙酸乙酯液,于3000 r/min離心15 min,取上清液減壓濃縮至干,此提取物部分經超高壓液相色譜三重四極桿串聯質譜聯用儀檢驗,結合并依據相關文獻,分析鑒定其中主要成分。

1.2.2質譜條件電離方式:EI+、離子源溫度:250 ℃、電子能量:70 eV、分辨率:10000、掃描范圍:檢測質量數±40 pDa。

1.2.3紅外光譜條件分辨率:4 cm-1、掃描范圍:400～4000 cm-1、制樣方式:KBr壓片。

1.2.4Agilent 1100 LC-MSD/TOF條件質譜條件:離子源:ESI;測定模式:正離子模式;毛細管電壓:3800 V;毛細管溫度:300 °C;干燥氣流速:7.0 L/min;霧化氣壓力:15 psig;裂解電壓:210 V;分離錐電壓:60V;八級桿電壓:250 V。

色譜條件:流動相甲醇∶水∶異丙醇70∶10∶20(v∶v∶v);流速0.2 mL/min。

1.2.5Waters Xevo TQ-S超高壓液相色譜三重四極桿串聯質譜聯用儀條件色譜柱:Aglilent zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相:A為乙酸乙酯,B為乙腈;流速:1 mL/min;柱溫:28 ℃;梯度洗脫程序:0～15 min,75% A～25% B;15～35 min,5% A～95% B;35～60 min,5% A～95% B。

離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:負離子掃描;檢測方式:多反應監測(MRM)模式;毛細管電壓:3800 V;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:350 ℃;脫溶劑氣流速:800 L/h。

1.2.6高效液相色譜條件色譜柱氨基柱XB-C18內徑(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:乙腈∶水=80∶20;流速:1 mL/min。蒸發光檢測器(ELSD):漂移管溫度20.3 ℃,氮氣流量:2.7 L/min,增益:1。

1.3定性分析

通過波譜、質譜、色譜分析數據鑒定化合物:由質譜確定樣品離子的質量,推導其分子式;由紅外光譜確定其化學鍵及官能團;核磁共振數據(氫譜)結合對照文獻報道初步確定化合物結構。

2　結果與分析

2.1三種化合物的結構鑒定

從1.2.1.1中分離的三個化合物A、B、C,采用波譜解析技術鑒定,分別為β-谷甾醇(β-sitosterol)、n-芐基十六烷酰胺(N-benzylhexadecanamide)、蔗糖(sucrose)。三種化合物的結構鑒定的數據如下:

2.1.1化合物A白色針晶,易溶于乙酸乙酯、石油醚等溶劑。該化合物EI質譜顯示m/zM+414為分子離子峰,紅外光譜證明有羥基(3424 cm-1),不飽和度為5,結合核磁共振氫譜確定其分子式為C29H50O。結合文獻[15],可推斷化合物A為β-谷甾醇,結果見圖1、圖2。

1H-NMR(500 MHz,CDCl3):5.33,5.34(1H,br.d,=C6-H),3.75,3.74,3.72(1H,t,=C3-H),0.99(3H,S,C19-CH3),0.67(3H,s,C18-CH3),2.27(2H,m,C4-CH2),1.99(2H,t,C7-CH2)。

圖1　化合物A谷甾醇1H-NMR圖譜 Fig.1　1H-NMR spectrum of compound A

圖2　化合物A分子結構圖(谷甾醇)Fig.2　Stucture of compound A

2.1.2化合物B白色結晶,易溶于乙酸乙酯、石油醚等溶劑。該化合物EI質譜顯示m/zM+345為分子離子峰,TOF-MS m/z 346.3219(C23H40NO),m/z 368.2932(C23H39NONa),m/z713.6018(C46H78N2O2Na),由此可推斷化合物B分子式為C23H39NO,分子量為345.3026,上述三個化學式分別為其M+1、M+Na、2M+Na峰;紅外光譜數據證明有酰胺基(3441,3443 cm-1);核磁共振氫譜δ7.27附近多重峰,5個芳氫原子;δ5.70 單峰為NH氫;δ4.43三重峰,2個氫原子,它們構成芐基酰胺結構,其余各峰為十六烷酸長鏈的氫原子。上述數據及結合文獻[16]鑒定化合物B為n-芐基十六烷酰胺。見圖3、圖4。

1H-NMR(500 MHz,CDCl3):7.27(5H,m,5Ar-H),5.70(1H,s,N-H),4.43(2H,t,C-17-H),2.18(2H,t,C-2-H),1.63(2H,m,C-3-H),1.28(2H,m,C-15-H),0.86(3H,C-16 CH3)。

圖3　化合物B n-芐基十六烷酰胺1H-NMR圖譜Fig.3　1H-NMR spectrum of compound B

圖4　化合物B n-芐基十六烷酰胺結構圖譜 Fig.4　Stucture of compound B

2.1.3化合物C白色粒狀結晶,易溶于水,有甜味。從核磁共振氫譜數據推測該物質為蔗糖,分子式為C12H22O11;用HPLC,與蔗糖、果糖、麥芽糖及葡萄糖標樣進行對照分析,證實化合物C為蔗糖。

1H-NMR(500 MHz,CDCl3):5.25(1H,d,C1-H),3.40(1H,dd,C2-H),3.60(1H,t,C3-H),3.32(1H,t,C4-H),3.68(1H,m,C5-H),3.66(2H,d,C6-H)上述均為葡萄糖單元;3.52(2H,s,C1′-H),4.06(1H,d,C3′-H),3.90(1H,t,C4′-H),3.73(1H,m,C5′-H),3.67(2H,d,C6′-H)上述均為果糖單元。氫譜見圖5。液相色譜圖見圖6、結構式見圖7。

圖5　化合物C瑪咖糖1H-NMR圖譜Fig.5　1H-NMRspectrum of compound C

圖6　化合物C瑪咖糖HPLC圖譜 Fig.6　HPLC spectrum of compound C

圖7　化合物C 瑪咖糖 分子結構式Fig.7　Structure of compound C

2.2活性部位中化合物的UPLC-UV-MS的結果與分析

通過1.2.1.2的提取方式,將其提取物中功能活性的化學成分集中,并通過UPLC-UV-MS分析鑒定,結合國外的相關文獻,分析確定含有5個瑪咖酰胺、2個咪唑生物堿及2個芥子油苷系列的化合物。

2.2.1瑪咖酰胺根據保留時間,獲得質荷比及相對分子質量,依據文獻報道[11-13,16],推測其分子離子峰,得到相應的分子式?；衔锏目傠x子流圖和離子質譜圖見圖8。

圖8　五個瑪咖酰胺化合物的色譜圖、質譜圖Fig.8　Chromatograms and MS spectra of five macamides

1、N-Benzyl-9-oxo-12Z,15Z-octadecadienamidem/z(M+Na)+406、(M+H)+384,Rt32.949 min

2、n-benzyl-(9Z,12Z,15Z)-octadecatrienamidem/z(M+Na)+390、(M+H)+368,Rt35.551 min

3、n-benzyl-(9Z,12Z)-octadecadienamidem/z(M+Na)+392、(M+H)+370,Rt36.969 min

4、n-benzyl-(9Z)-octadecenamidem/z(M+Na)+394、(M+H)+372,Rt39.137 min

5、n-benzyloctadecanamidem/z(M+Na)+396、(M+H)+374,Rt43.105 min

2.2.2瑪咖生物堿根據保留時間,獲得質荷比及相對分子質量,依據文獻報道[17],推測其分子離子峰,得到相應的分子式。Lepidiline A:m/z 291(M-Cl)+,保留時間15.2 min;Lepidiline B:m/z 291(M-Cl)+,保留時間23.158 min?；衔锏目傠x子流圖和離子質譜圖見圖9。

圖9　2個瑪咖生物堿化合物的色譜圖、質譜圖Fig.9　Chromatogram and MS spectra of two alkaloids

2.2.3芥子油苷根據保留時間,獲得質荷比及相對分子質量,依據文獻報道[18-19],推測其分子離子峰,得到相應的分子式?；衔锏目傠x子流圖和離子質譜圖見圖10,11。

圖10　瑪咖芥子油苷的色譜圖、質譜圖Fig.10　Chromatogram and MS spectra of glucosinolate of maca

圖11　瑪咖芥子油苷的色譜圖、質譜圖Fig.11　Chromatogram and MS spectra of glucosinolate of maca

2.2.3.1m-Methoxyglucotropaeolin:m/z 438(M-H)-,保留時間9.39 min。

2.2.3.2Glucotropaeolinm/z 408(M-H)-,保留時間8.354 min。

3　結論

瑪咖營養成分對瑪咖的功效起到促進作用,因此國內大量的基礎工作集中在營養成分的分析研究上,活性成分研究甚少。本文主要研究云南栽培瑪咖的功能活性成分。通過在實驗室采取不同的提取分離及純化技術方式獲得三個化合物單體及確定含有5個瑪咖酰胺、2個咪唑生物堿及2個芥子油苷化合物,其目的主要是觀察云南栽培瑪咖中功能活性成分情況。從實驗結果中得到:其一瑪咖中分離出的蔗糖具有特殊的瑪咖香氣,屬首次,對拓展食品天然添加劑的開發有一定的開發前景;其二瑪咖功能性的成分主要為一些天然酯溶性的化合物[8],其瑪咖烯、瑪咖酰胺、芥子油苷、甾醇及酚類物質等都存在于60%～70%乙醇提取物中,因此可以利用其功能性成分特性,采取相應的提取方式,集中活性成分,為瑪咖作為膳食補充劑的食品營養產業起到有效的輔助作用。

[1]Mummenhoff K,Hurka H,Bandelt HJ. Systematics of AustralianLepidiumspecies(Brassicaceae)and implications for their origin:Evidence from IEF analysis of Rubisco[J]. Plant Syst

Evol,1992,183(1):99-112.

[2]DerMarderosian A,ed. Maca In Guide to Popular Natural Products[M].St Louis,MO:Wolters Kluwer Company,2001:157-158.

[3]余龍江,金文聞.瑪伽(Lepidiummeyenii.)干粉的營養成分及抗疲勞作用研究[J].食品科學,2004,25(1):164-166.

[4]楊晶明,王竹,楊月欣.瑪伽(Maca)干品營養成分分析與比較[J].中國食品衛生雜志,2007,19(3):201-205.

[5]杜萍,單云,孫卉,等. 云南瑪卡營養成分分析[J]. 食品科學,2010,31(24):345-347.

[6]孫曉東,杜萍,單云,等. 麗江瑪卡片和秘魯瑪卡片營養成分比分析和評價[J]. 食品科學,2011,32(19):214-216.

[7]單云,孫曉東,杜萍,等. 麗江產瑪卡根莖裂解-氣相色譜-質譜分析[J]. 食品科學,2011,32(24):244-247.

[8]Muhammad I,Zhao J,Khan I. Maca(Lepidiummeyenii)In Encyclopedia of Diatary Supplements[M]. New York:Coates,P,ed,2009:518-526.

[9]沈維治,鄒宇曉,林光月,等.瑪咖抗疲勞作用及活性組分研究[J].食品與生物技術學報,2014,33(7):721-726.

[10]Zheng BL,He K,Kim CH,et al. Effect of a lipidic extract fromLepidiummeyeniion sexual behavior in mice and rats[J]. Urology,2000,55(4):598-602.

[11]Muhammad I,Zhao J,Dunbar DC,et al. Constituents ofLepidiummeyenii‘maca’[J].Phytochemistry,2002,59(1):105-110.

[12]Ganzera M,Zhao J,Muhammad I,et al. Chemical profiling and standardization ofLepidiummeyenii(Maca)by reversed phase high performance liquid chromatography[J]. Chem Pharm Bull(Tokyo),2002,50(7):988-991.

[13]Zhao J,Muhammad I,Dunbar DC,et al. New alkamides from maca(Lepidiummeyenii)[J].Agric Food Chem,2005,53(3):690-693.

[14]鄭茜,張慶賀,盧丹,等.吉林產瑪咖的化學成分研究[J].中草藥,2014,45(17):2457-2460.

[15]董雪云,文波,沈云亨.寬葉兔兒風的化學成分研究[J].中草藥,2014,45(15):2148-2152.

[16]McCollom MM,Villinski JR,McPhail KL,et al. Analysis of macamides in samples of Maca(Lepidiummeyenii)by HPLC-UV-MS/MS[J].Phytochem Anal,2005,16(6):463-469.

[17]Cui B,Zheng BL,He K,et al. Imidazole alkaloids fromLepidiummeyenii[J]. Nat Prod,2003,66(8):1101-1103.

[18]Piacente S,Carbone V,Plaza A,et al. Investigation of the tuber constituents of maca(LepidiummeyeniiWalp.)[J]. Agric Food Chem,2002,50(20):5621-5625.

[19]艾中,程愛芳,孟際勇,等.國產瑪咖芥子油苷的組分分析和含量測定[J].食品科技,2012,37(4):182-186.

Analysis of the functional constituent in Maca (Lepidiummeyenii)from Yunnan

DU Ping,YANG Min,ZHU Yan-qin,HUANG Shao-jun,HE Yu-ping,LIU Run-min

(Research Center for Analysis and Measurement,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650093,China)

Study on chemical constituents of Maca(Lepidiummeyenii)in Yunnan. The classical phytochemical technique and silica gel column chromatography were isolated and purified. Structure and chromatographic and spectral properties of identified compounds had been identified. Compounds from three different extraction methods had been identified:β-sitosterol(A),n-benzylhexadecanamide(B)and sucrose(C). It was found that there were five main secondary metabolic product macamides,two imidazole alkaloids and two glucosinolates from the maca extract.

LepidiummeyeniiWalpers(Maca);N-benzylhexadecanamide;β-sitosterol;sucrose;macamides;imidazole alkaloids;glucosinolates

2016-01-04

杜萍(1968-),女,本科,高級工程師,研究方向:天然產物分析與研究,E-mail:duping515@sina.cn。

云南省應用基礎研究計劃項目(2012F2040)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)16-0071-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.005