小麥專用復方抗旱型浸種劑和包衣劑對小麥幼苗SOD、POD和CAT同工酶表達的影響

賈洪濤，胡曉君，邱奉同，張 莉

(臨沂大學生命科學學院，山東臨沂 276005)

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小麥專用復方抗旱型浸種劑和包衣劑對小麥幼苗SOD、POD和CAT同工酶表達的影響

賈洪濤，胡曉君，邱奉同，張 莉

(臨沂大學生命科學學院，山東臨沂 276005)

為從抗氧化酶同工酶表達方面了解小麥專用復方抗旱型浸種劑和包衣劑對小麥抗旱性的調節作用，以小麥品種臨麥2號為材料，采用盆栽試驗法，研究了小麥專用復方抗旱型浸種劑和包衣劑處理種子對干旱脅迫下小麥幼苗超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)同工酶表達的影響。結果表明，干旱脅迫下，小麥幼苗Mn-SOD和Fe-SOD表達量(活性)高于對照，而Cu/Zn-SOD同功酶表達量(活性)降低。與對照相比，干旱脅迫下，POD同工酶中的Rf 0.05、Rf 0.13、Rf 0.22和Rf 0.61條帶表達量降低，抗旱型包衣劑和浸種劑處理種子均提高干旱脅迫下Rf 0.05、Rf 0.13和Rf 0.61條帶的表達量，而普通包衣劑處理增加了Rf 0.18、Rf 0.22條帶的表達量。干旱脅迫降低了CAT同功酶Rf 0.04、Rf 0.76條帶的表達量，其中Rf 0.04表達量降幅較大，而抗旱型包衣劑和浸種劑處理種子均提高干旱脅迫下這兩個條帶的表達量，尤其是Rf 0.04的表達量顯著超過對照。說明抗旱型包衣劑和浸種劑能夠調控小麥幼苗抗氧化酶同工酶的表達，進而增強植株的抗氧化能力，提高小麥的抗旱性。

小麥；干旱脅迫；抗旱型浸種劑；抗旱型包衣劑；同工酶電泳

植物細胞內存在產生活性氧自由基的多種代謝途徑和高效率清除這些自由基的抗氧化系統[1-2]。在逆境脅迫下，植株體內活性氧自由基產生與清除動態平衡被打破，并導致自由基離子積累，進而導致膜脂過氧化或脫脂化，破壞膜結構及其完整性，引起膜透性增大，引起代謝紊亂[2-3]。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)是三種重要的抗氧化酶。其中，SOD以Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三種金屬蛋白的形式存在。Cu/Zn-SOD被氰化鉀和過氧化氫所抑制，Fe-SOD被過氧化氫所抑制，Mn-SOD對氰化鉀和過氧化氫不敏感，且已證明這三種SOD均存在于植物體中[4-6]。干旱會引起小麥幼苗SOD活性增高[9]。在干旱脅迫下，抗旱的小麥品種SOD活性升高且具持續性[8]。5%和15% PEG6000脅迫后，小麥種子萌發期POD、CAT活性均呈上升趨勢，但高濃度處理先升高而后降低[9]。在干旱和鹽脅迫下，小麥根部POD同工酶活性升高，但沒有酶帶變化，葉片POD同工酶活性降低且在鹽脅迫下少了一條譜帶[10]。但有研究表明，干旱脅迫下小麥幼苗根和葉POD同工酶A、B、C區的酶帶數目增加，且酶帶顏色均有不同程度的加深，根和葉中POD活性顯著增強[11]；抗旱性不同的小麥品種功能葉POD同工酶活性和酶譜在受到干旱脅迫后均會發生變化，某些同工酶活性的增加與小麥的抗旱性呈正相關[12]。上述研究結果說明， 抗氧化酶活性與小麥抗旱性密切相關，因此可通過栽培等措施對其進行調節，以增強植株抗旱能力。

化學調控是提高小麥抗旱能力的一種重要方法。在干旱條件下施FA后小麥幼苗的SOD和POD活性增高，植株抗旱能力增強[13]。使用種衣劑可使SOD活性升高，起到延緩小麥植株衰老和誘導產生抗逆性的作用[14]。外源精胺能夠提高水分脅迫下小麥葉片SOD、CAT 和 POD 活性，且抗旱性弱的品種的保護酶活性增幅高于抗旱性強的品種[15]。在干旱脅迫下，低濃度外源NO供體硝普鈉處理可顯著提高小麥幼苗葉片 SOD、POD和CAT 活性，緩解膜脂過氧化[16]。噴灑殼聚糖提高了干旱脅迫下小麥幼苗SOD、 POD 及 CAT 活性[17]。雖然單一成分的化控物質可提高小麥抗旱能力，但效果往往有限，因此開發有更好效果的復合型化控試劑或產品十分必要。

我們自主研發的小麥專用復方抗旱型浸種劑和包衣劑含有植物所需的大量和微量元素、植物生理活性物質、植物抗逆調控因子等成分，使用其處理小麥種子后，幼苗抗旱能力顯著提高[18]。目前，有關小麥專用復方抗旱型浸種劑和包衣劑作用機理的研究很少。本研究試圖從抗氧化酶同工酶表達方面探討抗旱型包衣劑和浸種劑對小麥幼苗抗旱性的調節機制，以期為此種浸種劑和包衣劑的推廣應用及新產品的開發提供參考。

1　材料與方法

1.1材 料

供試小麥為臨麥2號，種子購于山東省臨沂市種子公司。小麥專用復方抗旱型浸種劑和包衣劑均由本課題組成員賈洪濤主持研制。

1.2培養條件

試驗采用盆栽方式，用土采自大田耕層，土壤先過35目篩，風干后混合均勻后裝入直徑30 cm、高35 cm的盆中，每盆6 kg。供試土壤pH 7.4，有機質含量281 mg·kg-1，速效氮含量126.8 mg·kg-1，速效磷含量38.4 mg·kg-1，速效鉀含量118 mg·kg-1。

1.3材料處理

Yangzhou summit of 2018 World Green Design Forum held 7 60

選取大小一致、無病蟲害的小麥種子用于試驗。試驗設對照(CK)、干旱(D)、普通包衣劑+干旱(PD)、復方抗旱型包衣劑+干旱(FBD)和復方抗旱型浸種劑+干旱(FJD)5種處理。CK和D處理的種子均不進行任何處理；PD處理使用江蘇銅山農藥總廠生產的銅農牌15%甲拌懸浮種衣劑對種子進行人工包衣，包衣劑與種子比例為1∶80；FBD處理使用小麥專用復方抗旱型包衣劑進行人工包衣，包衣劑與種子比例為1∶80；FJD處理使用小麥專用復方抗旱型浸種劑25 ℃浸泡種子12 h，中間攪拌三次，晾12 h播種，浸種與種子比例為1∶1.5。

1.4試驗方法

將未處理及經過包衣或浸種處理過的種子分別均勻播種于相應的花盆中，每盆50粒，小麥幼苗長到3片真葉時每盆定苗40株，CK處理土壤含水量維持在田間持水量的70%(通過稱重法控制)，其他處理同時停止澆水進行干旱處理。待干旱處理的小麥幼苗葉片開始出現萎蔫、第一片葉下垂時，所有處理取樣幼苗地上部分，進行同工酶樣品制備。使用GE公司Image Scanner 掃描記錄同工酶電泳圖像，用Gel-Pro Analyzer分析記錄條帶數，測量每條電泳條帶的累積光密度(IOD，亦稱積分光密度)，用每條條帶的累積光密度值表示酶活性大小，并繪成Excel折線圖。

1.4.1同工酶樣品的制備

通過預試驗比較了不同研究者常用的四種提取液電泳效果。四種提取液分別為提取液Ⅰ[0.10 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)][19]、提取液Ⅱ[0.05 mol·L-1磷酸緩沖液(PBS，pH 6.6)][20]、提取液Ⅲ[0.10 mol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH 7.2),含5% 蔗糖、0.5% (w/v) PVP、10 mmol·L-1β-巰基乙醇][21]和提取液Ⅳ[0.10 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.8)，含0.000 1 mol·L-1EDTA、1.0% (w/v) PVP和 0.5 % (v/v) Triton X-100]。提取液體積(mL)和新鮮材料重量(g)比例為 3∶1；研缽-20 ℃ 預冷，提取液4 ℃ 預冷；10 000 r·min-14 ℃ 離心30 min；Brandford法測定可溶性蛋白含量，小牛血清蛋白(BSA)作標準蛋白；-20 ℃保存提取液。

四種提取液中提取液Ⅲ和提取液Ⅳ電泳結果條帶較清晰，數量較多，因此本研究選用這兩種提取液作為同工酶提取液成分的依據，并對其作了改良，改良后的配方為0.10 mol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH 7.2)中含10% 甘油、0.002 mol·L-1EDTANa2、0.10% (v/v) Triton X-100、4.0% (w/v)PVP、1.0% β-巰基乙醇，提取液分裝后-20 ℃保存備用。改良后提取液電泳圖像條帶更清晰，條帶更多，酶樣品-20 ℃儲藏時間更久。

1.4.2非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；分離膠SOD濃度為10%，POD和CAT均為7.5%，濃縮膠濃度均為3%；上樣量統一為15 μg可溶性蛋白；穩流，濃縮膠電流為10 mA·膠-1，樣品進入分離膠后，加大電流至20 mA·膠-1[22]。電泳儀為美國通用電氣公司(GE)EPS301電源和Hoefer○RminiVE電泳槽，每個樣品分別點兩個泳道。

SOD同工酶電泳膠染色采用氯化硝基四氮唑藍(NBT)負染色法，不同SOD同工酶亞型的鑒定采用氯仿-乙醇抑制法、氰化鉀(KCN)抑制法和過氧化氫(H2O2)抑制法[6,23]。

POD同工酶電泳膠染色參照吳少伯的方法[24]并進行了改良。改良后的染色液為每100 mL 0.05 mol·L-1pH 4.6乙酸緩沖液中包含0.1 g少量丙酮溶解的聯苯胺、70 mg抗壞血酸，染色前加入0.75 mL 3%H2O2。剝下凝膠，放入染色液中30 ℃暗處孵育，直至褐色條帶出現，去離子水沖洗后掃描。

CAT同工酶染色采用改良淀粉-碘反應方法[25]。具體步驟：灌制含0.1%可溶性淀粉的聚丙烯酰胺分離膠凝膠，電泳結束后，將膠剝離并沖洗兩遍，放入含100 mL含0.15 g H2O2、0.14 g Na2S2O3·H2O 的pH 7.0 PBS緩沖液(現配現用)中，室溫振蕩15 min，沖洗兩次，再放入去離子水配制的100 mL含0.0 747 g KI和1 mL冰乙酸(新鮮加入)的染色液中，室溫下振蕩至膠出現淺藍色時用掃描儀掃描記錄，連續掃描幾次，透明的條帶因藍色漸濃而呈現時間較短暫。

2　結果與分析

2.1小麥幼苗葉片SOD同工酶亞型鑒定結果

SOD同工酶電泳結果共顯示了5個條帶，分別是Rf 0.25、Rf 0.35、Rf 0.37、Rf 0.55、Rf 0.58(圖1)。H2O2抑制結果僅顯示Rf 0.25條帶，因為Cu/Zn-SOD在H2O2作用5 min內會急劇失活，Fe-SOD活性也受到較大影響，只有Mn-SOD活性比較穩定，故Rf 0.25條帶應為Mn-SOD；氯仿-乙醇抑制結果僅顯示Rf 0.55、Rf 0.58條帶，Mn-SOD和Fe-SOD在氯仿-乙醇溶液里會迅速失活，而Cu/Zn-SOD能保持24 h內活性穩定，故條帶Rf 0.55、Rf 0.58應為Cu/Zn-SOD；氰化鉀抑制結果僅顯示Rf 0.25條帶，由于Mn-SOD在70 min內穩定，而Fe-SOD和Cu/Zn-SOD活性均不同程度下降，也說明Rf 0.25條帶應為Mn-SOD；因三種抑制物質均對Fe-SOD活性有影響，所以三種抑制物質染色結果均看不到Rf 0.35和Rf 0.37，故這兩個條帶應為Fe-SOD。

1：SOD亞型；2：CK；3：加入H2O2；4：加入氯仿-乙醇；5：加入KCN

1：SOD isozyme isoforms;2:CK;3:Adding H2O2;4:Adding choroform-ethanol;5:Adding KCN

圖1小麥葉片SOD亞型的鑒定結果

Fig.1Identification of SOD isozyme isoforms in the leaves of wheat seedlings

2.2小麥專用復方抗旱型浸種劑和包衣劑對小麥葉片SOD同工酶表達的影響

從圖2和圖3可以看出，干旱脅迫下，Mn-SOD活性變化幅度較小，其中FBD和FJD處理的Mn-SOD活性較CK略有升高；干旱脅迫下，各處理的Fe-SOD活性均較高，其中FBD和FJD處理較D處理下降，但略高于CK；Cu/Zn-SOD活性表現為FBD和FJD處理低于其他處理。

2.3小麥專用復方抗旱型浸種劑和包衣劑對小麥苗期葉片POD同工酶表達的影響

從圖4和圖5可以看出，干旱脅迫對小麥幼苗POD同工酶表達影響較大，使其條帶數量、寬度和顏色深淺均發生了變化。相對CK處理，D處理中Rf 0.05、Rf 0.13、Rf 0.22和Rf 0.61條帶表達量降低，而FBD和FJD處理表達量均提高，以Rf 0.61變化最顯著，且D和FBD處理增加了Rf 0.33、Rf 0.39條帶表達量；D和PD處理增加了Rf 0.18、Rf 0.22兩個條帶的表達量。

圖2　不同處理下小麥苗期葉片SOD同工酶的表達Fig.2　Expression of SOD isozyme in the leaves of wheat seedlings under different treatments

1：CK;2：D;3：PD;4：FBD; 5：FJD。下圖同The same as in the following figures

圖3不同處理下小麥苗期葉片SOD同工酶活性的差異

Fig.3Activity variation of SOD isozyme isoforms in the leaves of wheat seedlings under different treatments

圖4　不同處理下小麥苗期葉片POD同工酶的表達Fig.4　Expression of POD isozyme in the leaves of wheat seedlings under different treatments

圖5　不同處理下小麥苗期葉片POD同工酶活性的差異Fig.5　Activity variation of POD isozyme in the leaves of wheat seedlings under different treatments

2.4小麥專用復方抗旱型浸種劑和包衣劑對小麥苗期葉片CAT同工酶表達的影響

從圖6和圖7可以看出，小麥幼苗地上部分CAT同工酶電泳顯示Rf 0.04、Rf 0.76兩個條帶。D處理明顯降低了這兩個條帶的表達量，其中Rf 0.04變化幅度較大；FBD和FJD處理顯著增加了Rf 0.04、Rf 0.76的表達量，尤其是Rf 0.04變化較明顯。

圖6　不同處理下小麥苗期葉片CAT同工酶的表達Fig.6　Expression of CAT isozyme in the leaves of wheat seedlings under different treatments

3　討 論

干旱脅迫下，小麥幼苗SOD、POD和CAT同功酶活性和/或酶帶發生了變化。其中， Fe-SOD活性升高，Cu/Zn-SOD活性降低，Mn-SOD活性變化較小。一些研究結果顯示，干旱脅迫使SOD活性升高[7-10]，這應該是Fe-SOD活性變化的結果。本研究中，干旱脅迫導致POD同工酶活性降低，這與部分研究者的結果不一致。抗旱型包衣劑和抗旱型浸種劑處理顯著增加了POD同工酶Rf 0.05、Rf 0.13和Rf 0.61條帶的表達量，尤其是Rf 0.61條帶變化最顯著，這與一些研究者的結果相一致[13-18]。干旱脅迫下，CAT同功酶Rf 0.04、Rf 0.76條帶表達量均降低，抗旱型包衣劑和抗旱型浸種劑處理顯著增加了這兩個條帶的表達量，這一結果尚未見文獻報道。用抗旱型包衣劑和抗旱型浸種劑處理能夠顯著增加小麥幼苗的抗旱能力[18]。馮彩平[12]認為，POD同工酶酶帶活性的增加與小麥的抗旱性存在正相關關系。本研究結果顯示，抗旱型包衣劑包衣和抗旱型浸種劑浸種處理種子增加了Fe-SOD活性、POD同工酶活性和CAT同工酶活性，有助于增強小麥幼苗抗旱性。因此推測抗旱型包衣劑和抗旱型浸種劑對小麥幼苗抗氧化酶同工酶表達的影響可能與相關基因調控有關，但還需要進一步研究證實。

圖7　不同處理下小麥苗期葉片CAT同工酶活性的差異Fig.7　Activity variation of CAT isozyme in the leaves of wheat seedlings under different treatments

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The Effects of Compound Anti-drought Seed Soaking Agent and Seed Coating Agent on SOD, POD and CAT Isozyme Expression in Wheat Seedlings

JIA Hongtao,HU Xiaojun,QIU Fengtong,ZHANG Li

(Institute of Life Science,Linyi University,Linyi,Shandong 276001,China)

The effects of anti-drought seed soaking agent and seed coating agent on the oxidation reduction system isozyme expression were explored with wheat variety Linmai 2 under drought stress by controlling soil moisture in plant pots. The results showed that the Mn-SOD and Fe-SOD isozyme amount (activity) were higher than control; Cu/Zn-SOD isozyme amount (activity) was lower than control under drought stress; The POD isozyme expression results showed that the amount of band Rf 0.05, Rf 0.13, Rf 0.22 and Rf 0.61 was less than contrast under drought treatment; The amount of band Rf 0.05, Rf 0.13 and Rf 0.61 were exceeded over control by the treatments of “ anti-drought seed soaking agent” and “anti-drought seed coating agent” under drought stress; The new bands of Rf 0.18 and Rf 0.22 appeared under “drought stress” and “anti-drought seed soaking with drought stress” .The CAT expression showed that the amounts of band Rf 0.04 and Rf 0.76 were lower than control under “drought stress” treatment;The amounts of band Rf 0.04 and Rf 0.76,especially Rf 0.04 were significantly higher than control under the “anti-drought seed soaking with drought stress” and “anti-drought seed coating with drought stress” treatments. In summary, the seeds treated by drought-resistant seed soaking agent or seed coating agent could enhance isozyme expression by upgrading oxidation reduction system under drought stress, which increased drought-resistant and antioxidant ability of wheat seedling.

Wheat; Drought stress; Drought-resistant seed soaking agent; Drought-resistant seed coating agent; Isozyme electrophoresis

時間：2016-05-10

2015-11-15

2015-12-21

山東省科技攻關項目(2009GG10009040); 國家自然科學基金項目(No.31000744);山東省中青年科學家獎勵項目(BS2010SW004)

E-mail：ht_jia@163.com

S512.1；S311

A

1009-1041(2016)05-0647-06

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160510.1625.032.html