大鼠肺微血管內皮細胞的體外分離培養與純化

梁宏偉，馮　波，2，朱雯宇，王建舫，張　濤，穆　祥*

(1.北京農學院動物科學技術學院/獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農業大學動物醫學院，北京 100193)

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大鼠肺微血管內皮細胞的體外分離培養與純化

梁宏偉1，馮波1，2，朱雯宇1，王建舫1，張濤1，穆祥1*

(1.北京農學院動物科學技術學院/獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農業大學動物醫學院，北京 100193)

旨在建立一種簡單易行、獲得細胞純度較高的體外分離、培養大鼠肺微血管內皮細胞的方法。取5～7日齡SD大鼠分離外周肺組織，組織植塊法獲得原代大鼠肺微血管內皮細胞，37 ℃、5% CO2培養箱中傳代培養，采用免疫磁珠法對其進行分離純化，并對分離純化后的細胞進行免疫熒光及流式細胞鑒定，通過MTT比色分析法準確、安全、可靠地檢測純化后傳代肺微血管內皮細胞的增殖情況。結果顯示：倒置顯微鏡下觀察單個細胞呈短梭形或多角形，匯合后呈鋪路石樣，單層貼壁生長，細胞分離純化后經免疫熒光檢測CD31呈陽性，流式細胞儀檢測淋巴管內皮細胞表面特有標記VEGFR-3呈陰性(P=0.1，且P<0.5)，且復蘇后經MTT測得傳代細胞的增殖情況良好。成功建立了一種分離高純度大鼠肺微血管內皮細胞的體外培養方法。

大鼠；肺微血管內皮細胞；體外分離培養；免疫磁珠純化

微血管內皮細胞(microvascular endothelial cells，MVECs)呈單層覆蓋于微血管內表面，是構成血管內外物質交換的一道重要屏障，也是循環血流剪切力和血液中危險因素的主要靶細胞，因而最易并且最早受到傷害。研究發現，微血管內皮細胞具有功能多樣性，它不僅是構成血管組織間屏障的重要成分，而且在調節免疫細胞功能[1]，保證機體內環境穩定，維持正常生理和免疫功能，以及介導疾病的發生、發展和轉歸[2]等方面都發揮重要的作用。當前已有研究證明，MVECs是諸多細菌毒素和病毒(如皰疹病毒[3]、艾滋病毒[4]等)等致病因子攻擊的主要作用細胞[5-6]。D.Manuela等報道H5N1亞型高致病性禽流感病毒可以在血管內皮細胞系和人肺微血管內皮細胞內復制[7-8]，并且誘導人肺微血管內皮細胞凋亡[9]。所以對于肺微血管內皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)功能和地位的研究越來越受到人們的重視。近年來人們進行了大鼠肺微血管內皮細胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells，RPMVECs)體外培養研究，構建實驗模型，對深入研究生理和病理情況下大鼠肺微血管內皮細胞的基因、表型、功能的變化及其調控機制具有重要意義。內皮細胞的培養技術始于1921年[10]，起初培養技術較落后，直到1963年Y.Maruyama第一次成功培養了人臍靜脈血管內皮細胞后才在技術上有所突破，成功分離了大血管內皮細胞[11]，對于MVECS來說，由于受到各種條件的限制，發展相對滯后。直到1980年，P.M.Davison等才成功分離培養了MVECs[12]。雖然國內外已有許多關于RPMVECs體外分離與培養方法的報道，但傳統的培養方法存在細胞游離少，生長緩慢，極易受到成纖維細胞等其他雜細胞污染[13-15]等問題，并且以往對RPMVECs的原代培養存在純度低，難度大，成功率低，重復性差，成本高等弊端。本研究是在對原代RPMVECs經長期培養后，針對SD品系大鼠的原代PMVECs組織塊培養法中常見問題加以歸納、總結，細節技術加以改進，并對所培養細胞分離純化和鑒定，旨在提高RPMVECs體外培養方法的可靠性和重復性，而建立的一套操作簡便且純度高的系統的RPMVECs原代培養方法。

1　材料與方法

1.1試驗時間、地點

試驗于2015年10月至2016年3月在北京農學院動物科學技術學院/獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室進行。

1.2試驗動物

5～7日齡SD大鼠，雌雄均可，購自中國科學院遺傳所實驗動物中心。

1.3主要儀器和器材

CO2培養箱(日本SANYO，型號：MCO-17AC)，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS，型號：IX71-A21PH )，高速低溫離心機(SIGMA 6-16K)，DG-ò型酶聯儀(南京電子管廠)，流式細胞儀(美國 BD 公司，型號：FACSAria Ⅲ 型)，細胞培養板(Costar公司，型號：3516)，超菌工作臺(哈爾濱東聯電子技術開發有限公司，型號：DL-CF-IND)。

1.4試劑

D-Hank’s(GIBCO，批號：H2387)，胎牛血清(FBS，PAA Laboratories Gmbh，批號：A04105-1121)，DMEM高糖培養基(Sigma，批號：1136551)，胰蛋白酶(1∶250，Gibco，批號：2750018)，L-谷氨酰胺(Sigma，批號：03126)，兔抗大鼠CD 31單克隆抗體(Origene，批號：TA504773)，FITC標記的羊抗兔二抗(Abcam，批號：ab6785)，DAPI染色液 (北京博奧森生物技術有限公司，批號：C-0033)，ECGS (Millipore，批號：02-102)，肝素鈉(萬通藥業，批號：H32022088)，MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(Sigma，批號：C0009)，CELLECTION PAN MOUSE IGG KIT(Invitrogen，批號：11531D)，血管內皮生長因子受體3(VEGFR-3，北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-2202R-FITC)。

1.5RPMVECs的原代培養

取5只5～7日齡SD大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡消毒，無菌取出肺，冷D-Hank’s清洗3次，在干濾紙上剪取肺邊緣組織(3 mm左右)，緩慢滾動去除臟層胸膜后，置于少量胎牛血清中，并剪成小于1 mm×1 mm×1 mm大小的，近于糊狀的組織塊。然后采用組織塊植塊法，用移液槍均勻涂于6孔培養板底部。將培養板倒置于37 ℃含體積分數5% CO2細胞培養箱中，使組織塊貼壁 30 min后緩慢滴加20% DMEM培養基(20% FBS，2% L-谷氨酰胺、青霉素1×104U·mL-1、鏈霉素1×104U·mL-1、ECGS 15 μg·mL-1、1.5%肝素鈉)，以剛好浸沒組織塊為宜。于37 ℃、5% CO2恒濕恒溫培養箱中培養24 h后換液，90 h棄組織塊，待細胞匯合成團消化傳代[9]。

1.6RPMVECs的傳代培養

選取生長至完全匯合狀態的培養孔，吸棄原培養基，用37 ℃預熱的D-Hank’s清洗3次后每孔加入0.5 mL 0.05%胰蛋白酶(含0.005% EDTA)，顯微鏡下觀察，待細胞間連接疏松，且大部分細胞收縮變圓變亮時立即終止消化，以1 000 r·min-1室溫離心5 min后棄上清，加培養基混勻，按1∶2比例接種于細胞培養板繼續培養[17]。待RPMVECs傳至第2～3代時分離純化，培養至第5代左右，細胞狀態最佳時用于試驗研究。

1.7RPMVECs的免疫磁珠分離純化

待細胞傳到第2～3代時采用免疫磁珠純化法[16]直接分離純化得到RPMVECs。向盛有預洗過磁珠的離心管中加入一抗，室溫下孵育30 min，磁力震動后棄去上清，重復操作一次，加入細胞懸液并混懸，2～8 ℃ 孵育20 min，用200 μL緩沖液3懸浮磁珠并重復操作一次。

1.8RPMVECs的鑒定

1.8.1抗CD 31抗體免疫熒光染色將經免疫磁珠純化分離得到的RPMVECs接種在于預置有細胞培養專用圓形蓋玻片的培養板，于培養箱中靜置24 h，用預熱的(37 ℃) PBS漂洗3次，加入預冷的(4 ℃)4%多聚甲醛溶液固定20 min，加入一抗兔抗大鼠CD 31抗體，4 ℃孵育過夜，陰性對照組PBS代替一抗。與FITC標記的羊抗兔IgG 37 ℃ 孵育45 min，DAPI作用10 min。最后用超純水沖洗甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8.2流式細胞儀檢測血管內皮生長因子受體3(vascular endothelial growth factor-3，VEGFR-3)的表達取純化后的RPMVECs，常規法消化，2 000 r·min-1離心7 min，棄上清，PBS洗1次后重懸，制成大于1×109L-1的單細胞懸液，分至每個待測的流式管，0.1 mL·管-1，分別加入熒光標記的抗體及其相應的同型對照抗體，室溫避光孵育15 min，2 000 r·min-1離心7 min后300 μL PBS重懸后上機[16]。

1.9MTT比色分析法檢測傳代RPMVECs的增殖情況

取純化鑒定后對數生長期的大鼠肺微血管內皮細胞，采用常規方法將細胞凍存[17]。一段時間后，復蘇[17]細胞，MTT比色法[18]測定貼壁細胞增殖活性。選取復蘇后經傳代培養生長為單層的 RPMVECs，常規方法消化后，接種入 96 孔培養板中，細胞密度為1×104mL-1，同時設不含細胞的空白對照孔，每組設4個重復。37 ℃、5% CO2靜置培養，分別于RPMVECs傳代后0、24、48、72、96 h時加入MTT，繼續培養 4 h，加入Formazan溶解液，吹打至紫色結晶完全溶解后，用酶聯免疫檢測儀測定 570 nm 波長處的光吸收度OD值，比色時用空白孔調零，計算平均值，以時間為橫坐標，平均光吸收度為縱坐標繪制細胞生長曲線[19]。

2　結　果

2.1細胞形態學觀察結果

倒置顯微鏡下觀察肺組織塊貼于培養板后(圖1A)，24 h 開始逐漸有細胞游出(圖1B)，觀察并記錄下48 h 細胞的生長狀態(圖1C)，90 h 左右棄組織塊，觀察并記錄下棄組織塊前后、及棄后24 h 細胞的生長狀態(圖1D～F)，原代細胞生長5～7 d后，倒置顯微鏡下觀察到細胞多呈梭形或三角形，細胞質豐富、胞核清晰呈卵圓形，且由原來的分散集落逐漸融合形成細胞單層，呈鵝卵石鑲嵌狀排列，具有微血管內皮細胞典型的鋪路石樣形態，如若過度融合生長會因細胞過于緊密而呈現進行性細長紡錘形。此時可將原代細胞傳代，隨著傳代培養次數的增加細胞變為長梭形，并逐漸呈漩渦樣生長或聚集生長。若傳代次數過多將會導致原代RPMVECs貼壁率下降，純度降低，則不再適宜試驗研究。因此，本試驗根據細胞的生長情況，當細胞傳至第2～3代時采用免疫磁珠純化法直接分離純化，并對純化后的細胞進行相關抗原的鑒定，以保證細胞的純度。

2.2RPMVECs經免疫磁珠分離純化的結果

通過磁珠純化系統純化細胞，用CD 31因子抗原進行篩選。光學顯微鏡下觀察并記錄RPMVECs在免疫磁珠分離純化前、后經0、24、72 h細胞的對比形態(圖2)。純化前的細胞中混有雜細胞，經CD31免疫磁珠篩選，以確保培養出純度高、大小均一，狀態良好的RPMVECs。

2.3CD31抗原鑒定結果

CD31免疫熒光染色結果呈陽性(圖3)，在倒置熒光顯微鏡下RPMVECs的細胞質和細胞膜呈典型的黃綠色熒光，如圖3L，而細胞核不著色。細胞質與細胞核間界限明顯，細胞整體呈梭形或多邊形。但經DAPI染色后細胞核呈典型的藍紫色熒光，如圖3M，熒光染色圖片疊加后結果如圖3N所示。

A.肺組織塊貼于培養板；B.24 h 細胞游出；C.48 h 所游出細胞的生長狀態；D.90 h棄組織塊前細胞的生長狀態；E.棄掉組織塊后細胞的狀態；F.棄組織塊后24 h細胞的生長狀態A.Lung tissue blocks attached to culture plate；B.24 h cells swim out；C.The growth state of the 48 h cells；D.The growth state of cells in abandoned tissues；E.The state of cells after abandoning tissues；F.The growth state of the cells after 24 hours of abandoned tissues圖1　原代培養的細胞形態Fig.1　The cell morphology of primary culture

G.RPMVECs分離純化前的生長狀態；H.RPMVECs分離純化后0 h的生長狀態；I.RPMVECs分離純化后24 h的生長狀態；J.RPMVECs分離純化后72 h的生長狀態G.The growth state of RPMVECs before separation and purification；H.The growth state of RPMVECs after 0 h was isolated and purified；I.The growth state of RPMVECs after 24 h was isolated and purified；J.The growth state of RPMVECs after 72 h was isolated and purified圖2　RPMVECs分離純化前、后的結果Fig.2　The growth state of RPMVECs before and after purification

2.4細胞免疫表型的測定

由于對肺部血管內皮細胞篩選時最可能混有淋巴管內皮細胞，且淋巴管內皮細胞特有的表面標記物為VEGFR-3抗體，經流式細胞儀檢測表達結果呈陰性(P=0.1，且P<0.5)，則說明分離純化后的細胞無淋巴管內皮細胞混雜，見圖4。

K.倒置熒光顯微鏡明場下RPMVECs的生長狀態；L.RPMVECs細胞膜上的CD31 抗原熒光染色的結果；M.RPMVECs細胞核經DAPI熒光染色的結果；N.倒置熒光顯微鏡熒光激發下RPMVECs的生長狀態K.Inverted fluorescence microscope RPMVECs off-court growth state；L.Results of RPMVECs membrane CD31 antigen fluorescence staining；M.Results of RPMVECs nuclei by DAPI fluorescence staining；N. Inverted fluorescence microscope fluorescence inspired RPMVECs growth state圖3　CD31抗體鑒定結果Fig.3　Cell identification for CD31 antigen

圖4　VEGFR-3表達結果呈陽性的細胞占所分選細胞的比例Fig.4　The proportion of VEGFR-3 positive cells in selected cells

2.5分離純化后RPMVECs的凍存和復蘇

待RPMVECs培養至對數生長期時(圖5O)，采用常規方法消化細胞后嚴格按照梯度凍存法[22]步驟要求將細胞凍存，將凍存管迅速移入液氮容器罐內儲存。為檢測分離純化后細胞的狀態，取出凍存管，將細胞復蘇，接種于6孔培養板中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，次日觀察(圖5P)細胞形態一致，呈卵圓形，大小均一，說明分離純化所得細胞狀態好，抗凍存能力強，換液后繼續傳代培養。

2.6MTT法檢測純化后傳代RPMVECs的增殖情況

MTT法測定復蘇后傳代RPMVECs生長曲線，檢測共用4 d，最后以培養時間為橫軸，每日測得的細胞平均吸光度值為縱軸，單點標示出細胞每日平均吸光度值，連接各點即成生長曲線圖(圖6)。由圖6可知，前3 d OD值與時間呈正相關，如圖中0～72 h段所示，第3天細胞量經對數期達到最大值，而后OD值稍有降低，即第四天后細胞生長進入平臺期，增殖速率放緩，如圖中72～96 h段所示。

O.凍存前RPMVECs細胞形態；P.復蘇后RPMVECs細胞形態O.Cell morphology of RPMVECs before cryopreservation；P.Cellular morphology of RPMVECs after resuscitation圖5　分離純化后RPMVECs的抗凍存能力Fig.5　Ability of RPMVECs against cryopreservation ofter isolation and purification

圖6　MTT作用時間對RPMVECs增殖反應的影響Fig.6　Affection of MTT effect time on RPMVECs proliferation response

3　討　論

血管內皮細胞是覆蓋于血管內膜表面呈單層扁平或多角形的細胞，具有多種生物學功能：參與血管活性物質代謝；參與調節凝血、抗凝與纖溶；參與維持血管壁完整[20]。不同部位的血管內皮細胞在形態學、表型和功能等方面均有所不同。肺微血管內皮細胞在物質轉運、急性肺損傷等過程中發揮重要作用，可見該細胞的體外培養成功與否，直接決定著體外研究流感病毒和內皮細胞間相互作用的關鍵。出于對這些生理功能及病理作用的研究，國內外開展肺微血管內皮細胞的原代培養已近20年，目前國際上對該細胞體外培養方法多為酶消化法[21-22]及組織植塊法[23]，本試驗在原代細胞培養過程中對以往的組織植塊法加以改進。

在原代RPMVECs培養過程中，大鼠外周肺組織的正確取材是成功的前提，嚴格剪取外周肺組織可以減少大血管內皮細胞和平滑肌細胞的污染[14]。既往的研究對外周肺組織取材的厚度并未作出明確界定，本研究參考多名學者以往的培養方法[24]，將取材范圍嚴格控制在肺葉邊緣3 mm左右。以往關于原代PMVECs分離培養的文獻中所介紹[20]，多數是將所取肺組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，60 h后去除組織塊。但經多次試驗，摸索發現若將組織塊剪的更小，甚至接近于糊狀時，縮短 PMVECs 爬出時游離的距離。眾所周知組織塊法培養原代內皮細胞是根據細胞遷移能力的差異而分離出RPMVECs的，但分離過程中仍有可能混有雜細胞，所以要嚴格把控去除組織塊的時間，肺組織貼壁培養24 h 后血細胞開始游出，48 h后伴有PMVECs游出，72 h后開始游出的則是成纖維細胞，所以此前文獻多報道在組織塊貼壁培養60 h后將其去除[13-16]，理論上若此時去除組織塊，則培養板中只剩下血細胞和PMVECs，其中血細胞可通過換液和傳代的過程去除，但是此方法很難保證完全無成纖維細胞的混雜，況且貼壁培養60 h即棄掉組織塊，此時游出來的PMVECs數量較少，且增殖緩慢，不利于細胞生長。綜合以上因素，本試驗將棄組織塊的時間調整到貼壁培養90 h 后，因為此時游出的PMVECs數量已遠超于成纖維細胞的量，PMVECs已占明顯優勢，成纖維細胞的生長將明顯受到抑制，而后對那些不具備典型鋪路石樣的細胞進行機械刮除。同時本試驗對原代細胞的培養基加以改進，添加了促進內皮細胞生長因子ECGS 15 μg·mL-1和1.5%肝素鈉，該種培養基在促進PMVECs 生長的同時還可較好地抑制成纖維細胞的生長。運用改良后的組織植塊法大大提高了所分離原代RPMVECs的純度和數量，降低了雜細胞的污染程度，為進一步做細胞純化提供了有力的前提條件。

如何對培養出的貼壁內皮細胞進行分離純化，目前缺乏公認的特異性方法和標志。“鵝卵石”或“鋪路石”樣形態被認為是內皮細胞的特征性細胞形態，但是文獻[24]報道及本試驗結果顯示，傳代培養細胞形態可發生變化，主要表現為梭形或多角形。因此，培養細胞除進行形態學觀察判斷外，必須對已得到的原代RPMVECs進行分離純化。目前，國際上已形成的PMVECs純化的方法主要有生物特性選擇法、物理剖除法、局部消化法、差速黏附法及免疫磁珠法[16，24]。本試驗中，作者采用免疫磁珠法分離純化原代RPMVECs，該法具有分離速度快、效率高、重復性強、操作簡單且不影響被分離細胞的生物學性狀和功能的特性，符合實驗室所用研究方法的要求。

為了獲得純度更高，更具有保種意義的原代RPMVECs，作者對分離純化后的細胞進行鑒定，鑒定方法多為免疫組化染色Ⅷ因子、CD31相關抗原[14-16]和流式細胞儀對細胞表面受體的檢測。此前對Ⅷ因子、CD31相關抗原表達的檢測一直被認為是內皮細胞免疫組織化學鑒定的經典指標。但在徐順貴等[13]的研究中PMVECs Ⅷ因子相關抗原的表達為陰性。所以本試驗采用免疫組化法對CD31相關抗原進行鑒定，而由于內皮細胞表面標記CD31的高表達僅限于1～3代[24]，所以作者選擇第2～3代細胞經免疫磁珠分離純化后鑒定，免疫熒光檢測CD31呈陽性。E.Kukk等[25]于1996年利用受體親和色譜法從前列腺癌細胞的胞外基質中提純出了血管內皮生長因子C DNA，血管內皮生長因子C是近年來發現的血管內皮生長因子家族新成員，并且可特異性地與淋巴管內皮細胞上的VEGFR-3結合，是目前所知唯一具有淋巴管生成作用的因子。分離純化肺部血管內皮細胞的過程中最可能混有淋巴管內皮細胞，且其表面特有標記為VEGFR-3抗體，所以將經CD31免疫磁珠純化后的細胞再經流式細胞儀檢測VEGFR-3抗體表達呈陰性，說明純化所得的RPMVECs無淋巴管內皮細胞的混雜。

復蘇分離純化后的RPMVECs，根據細胞狀態反映其較強的抗凍存能力，繼續傳代培養并采用MTT法檢測細胞增殖情況。經典MTT法簡便、迅速、準確、安全、價廉，已在醫學和生物學等許多研究領域中用于對細胞活性、細胞增殖和細胞毒性的檢測，但對于測定分離純化后傳代RPMVECs增殖情況的報道較少。其基本原理是活細胞的琥珀脫氫酶能還原MTT，形成不溶于水的藍紫色甲臜(formazam)結晶，加入有機溶劑結晶溶解，酶標儀測定的吸光度值便可準確直觀地反映活細胞的量。

4　結　論

成功建立了分離純度高、生長快的大鼠肺微血管內皮細胞的體外培養方法，且本改良方法簡便易行、可重復性強。

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(編輯白永平)

Cultivation and Purification of Rat Pulmonary Microvascular Endothelial Cellsinvitro

LIANG Hong-wei1，FENG Bo1，2，ZHU Wen-yu1，WANG Jian-fang1，ZHANG Tao1，MU Xiang1*

(1.BeijingKeyLaboratoryofTraditionalChineseVeterinaryMedicine，BeijingUniversistyofAgriculture，Beijing102206，China；2.VeterinaryMedicineinChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

This study aims at establishing a simple method of obtaining the high-purity rat pulmonary microvascular endothelial cells isolated and culturedinvitro.Peripheral lung tissues were separated from 5 to 7 days of SD rat under sterile condition.Rat pulmonary microvascular endothelial cells was acquired by taking the tissue graft block method，digested with trypsin and then maintained at 37 ℃ in a 5% CO2humidified atmosphere.The cells were purificated using the method of immune magnetic beads，subsequently identified by the immunofluorescence and flow cytometry，and then determined by MTT colorimetric analysis to detect the original generation of pulmonary endothelial cell growth curve.Rat lung microvascular endothelial cells was successfully obtained by taking the tissue graft block method and individual cells under inverted microscope showed short fusiform or polygon and a typical paying stone appearance with single-layer adherent growth after confluence.The cells were strongly positive for CD31 factor and negative(P=0.1，andP<0.5) for lymphatic endothelial cell specific surface marker VEGFR-3 detected by immunofluorescence staining and flow cytometry respectively.In our study，a method of higher purity of rat lung microvascular endothelial cells cultureinvitrowas successfully established.

rats；pulmonary microvascular endothelial cells；isolation and cultivation in vitro；immune magnetic beads purification

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.024

2016-06-15

國家自然科學基金(31272144)

梁宏偉(1990-)，女，河北承德人，碩士生，主要從事中獸醫藥及疾病防控方面研究，E-mail: 1581926010@ qq. com

穆祥(1960-)，男，江蘇啟東人，教授，碩士，主要從事中獸醫藥及疾病防控研究

S852.21

A

0366-6964(2016)10-2143-08