多殺性巴氏桿菌脂多糖的結構與功能研究進展

華瑞其，趙新新，2，3* ，程安春，2，3*

(1.四川農業大學動物醫學院預防獸醫研究所，成都 611130；2.四川農業大學動物醫學院禽病防治中心，成都 611130；3.四川農業大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130)

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多殺性巴氏桿菌脂多糖的結構與功能研究進展

華瑞其1，趙新新1，2，3*，程安春1，2，3*

(1.四川農業大學動物醫學院預防獸醫研究所，成都 611130；2.四川農業大學動物醫學院禽病防治中心，成都 611130；3.四川農業大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130)

多殺性巴氏桿菌是一種兼性厭氧的革蘭陰性菌，能夠造成多種動物的巴氏桿菌病。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)既是細菌重要的毒力因子，又是主要的保護性抗原。依據LPS血清學反應，多殺性巴氏桿菌可分為16個血清型。與大多數革蘭陰性菌不同，多殺性巴氏桿菌的脂多糖不含O-抗原，僅由類脂A和核心寡糖兩部分組成。近年來人們通過質譜檢測和基因測序陸續揭示了這16個血清型核心寡糖的化學結構和合成基因。研究表明，各血清型內核心寡糖結構十分保守，合成基因分散存在于基因組；外核心寡糖的化學組成具有多樣性，其合成基因成簇存在，形成外核心寡糖基因簇。雖然有些血清型共享同樣的外核心寡糖基因簇，但由于基因突變造成它們外核心寡糖結構的異質性。研究還發現核心寡糖的結構與多殺性巴氏桿菌的毒力有關。作者在本文中綜述了多殺性巴氏桿菌16個血清型的核心寡糖的化學結構、基因組成及其結構與毒力的關系，為多殺性巴氏桿菌病的防治提供借鑒。

多殺性巴氏桿菌；脂多糖；化學結構；基因組成；毒力

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)是一種兼性厭氧的革蘭陰性菌，可經呼吸道或消化道等方式感染宿主，造成多種動物的巴氏桿菌病，如豬萎縮性鼻炎、禽霍亂、豬肺疫、兔巴氏桿菌病、牛出血性敗血癥等；同時可經咬傷或接觸帶病動物鼻腔分泌物等途徑感染人[1]。巴氏桿菌病多呈急性經過，在全球范圍內流行，嚴重威脅著人畜健康[2]，被中國農業部定為二類重要動物傳染病。雖然多殺性巴氏桿菌的致病機制遠未被研究清楚，但它的一些毒力因子，如莢膜[3]、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)[4]、外膜蛋白[5]、多殺性巴氏桿菌毒素[6]、全局調控基因[7-8]等，在細菌致病過程中的作用正被逐漸揭示。值得注意的是，全局調控基因phoP、hfq不僅參與細菌的生長代謝，還能夠調控毒力因子的表達。phoP缺失造成鐵離子代謝相關基因tonB/exbB、LPS中Kdo合成相關基因kdsA/kdsB的下調表達[9]；hfq缺失則引起LPS中磷酸膽堿(phosphocholine，PCho)和磷酸乙醇胺(phosphoethanolamine，PEtn)合成相關基因的上調表達。這預示著多殺性巴氏桿菌毒力因子的表達不是一成不變的，其表達調控與全局調控基因信號網絡相關[10]。

脂多糖是革蘭陰性菌外膜重要的組成成分，為大多數革蘭陰性菌完成其感染過程所必需。研究表明，脂多糖是很多致病菌重要的毒力因子[11]，能夠幫助細菌抵抗宿主固有免疫應答的活性成分，如抗菌肽[12]或血清補體[4]，并能促進細菌在體內的存活；同時具有內毒素特性，能夠與宿主細胞表面的Toll樣受體4結合激活多種免疫細胞，引發細胞因子風暴而致病，甚至導致宿主的死亡[13-14]。大多數革蘭陰性菌，如大腸埃希菌、沙門菌等，脂多糖由類脂A、核心寡糖、O-多糖抗原三部分所組成[4]。其中，類脂A(lipid A)和核心寡糖十分保守，O-多糖具有多樣性，是劃分血清型的重要依據。然而，在多殺性巴氏桿菌、流感嗜血桿菌等少數細菌中，脂多糖不含O-多糖抗原，僅由類脂A和核心寡糖兩部分所組成，這種結構的脂多糖被稱為脂寡糖(lipooligosaccharide，LOS)。1972年K.heddleston等根據脂多糖抗原的不同，用瓊脂擴散沉淀試驗將多殺性巴氏桿菌分為15個血清型[15]，1978年K.Brogden等從火雞身上分離到第16個血清型[16]。近年來，人們利用質譜檢測技術已獲得多殺性巴氏桿菌16個血清型的核心寡糖的化學組成，結果表明核心寡糖由內核心寡糖和外核心寡糖組成，內核心寡糖具有A、B兩種形式，在大部分血清型中普遍存在，具有保守性；外核心寡糖則具有多樣性，除2、5型血清型外，其他血清型的外核心寡糖的結構均不一致。此外，多殺性巴氏桿菌的脂多糖的結構與細菌的毒力有關，缺失核心寡糖的合成基因會增強細菌對血清補體或抗菌肽的敏感性，也會導致細菌毒力的下降。作者將總結近年來的最新進展，綜述16種血清型核心寡糖的化學結構、合成基因及其與細菌毒力的關系，為脂多糖的后續研究或疫苗研制提供借鑒。

1　內核心寡糖

來自多殺性巴氏桿菌16個血清型的數據顯示，多殺性巴氏桿菌的LPS包括2種構型，命名為A和B，它們具有相同的外核心寡糖，但內核心寡糖結構不同。如圖1所示，A型LPS和B型LPS的內核心寡糖結構的差異在于：(1)B型中連接于類脂A的是2個Kdo基團，而A型則為1個磷酸化的Kdo基團；(2)A型的1號庚糖(heptose，Hep)連接1個額外的葡萄糖(glucose，Glc)殘基；(3)在大多數情況下，A型的2號庚糖還會連接磷酸乙醇胺(PEtn)基團。研究表明，大多數多殺性巴氏桿菌會同時表達A、B兩種型的內核心寡糖，但以A型的表達為主[3]。此外，研究還發現多殺性巴氏桿菌的A型內核心寡糖也存在于親緣關系較近的溶血曼氏桿菌和胸膜炎放線桿菌中[17]。

通過生物信息學分析和多種突變株的LPS結構鑒定，合成多殺性巴氏桿菌內核心寡糖所需的絕大多數轉移酶及其基因已被揭示(圖1)。A型lipid A外端Kdo-P基團的連接由兩個酶催化完成，其中KdtA酶催化完成Kdo基團的連接，KdkA激酶催化完成Kdo基團的磷酸化[18]；而B型Lipid A外端Kdo-Kdo基團的連接由KdtA酶催化完成[4]。隨后，HptA酶、HptB酶分別將1號庚糖連接于A、B型內核心寡糖的Kdo基團[19]，HptC酶、HptD酶則分別介導兩種型2號庚糖、3號庚糖的連接。當庚糖側鏈合成完成后，在GctB轉移酶的催化作用下，1號葡萄糖殘基被連接于A、B型的1號庚糖；同時，GctA酶將2號葡萄糖殘基連接于A型的1號庚糖[3]。在某些菌株中，如血清型3 PM70株，A型內核心寡糖的2號庚糖還會連接磷酸乙醇胺殘基，這由lpt_3基因所調控。圖1列出了合成這些轉移酶的基因及其發揮作用的位置。研究證實，這些基因位于多殺性巴氏桿菌基因組的幾個不同片段上[19-20]，其中kdtA、kdkA、hptA、gctB基因位于同一位點，hptB、hptC基因位于基因組上的另一個位點且共享同一個啟動子，hptD、gctA、lpt_3基因則分別獨立存在于基因組的不同位點。

圖1　兩種多殺性巴氏桿菌脂多糖內核心寡糖的化學結構[3]Fig.1　Two structures of Pasteurella multocida LPS inner core oligosaccharide[3]

2　外核心寡糖

通過多種突變株的構建和質譜分析，多殺性巴氏桿菌16種血清型的外核心寡糖的化學結構和合成基因相繼被揭示或預測[20-26]。相比內核心寡糖的保守性，多殺性巴氏桿菌的外核心寡糖具有多樣性，除了血清型2和5具有相同的外核心寡糖之外，其余14種血清型的外核心寡糖的化學結構均不一致，這源于它們具有多樣性的合成基因[3]。研究表明，合成外核心寡糖的基因在基因組中成簇存在，形成外核心寡糖基因簇，它位于保守基因priA和fpg之間[4]。圖2顯示了16種血清型外核心寡糖的化學結構和相應的基因簇組成，根據基因簇的相似性將外核心寡糖分為8個型，即L1～L8型[27]。如圖所示，同一型具有相同的外核心寡糖基因簇，但因基因簇中某些基因的突變最終導致同一型內各血清型外核心寡糖化學結構的不同。

在禽類上廣泛流行的血清型1的LPS結構及合成基因是最早被揭示的。血清型1的外核心寡糖基因簇由6個基因組成，包括：hptE，編碼庚糖轉移酶，負責將4號庚糖連接于內核心寡糖中的1號葡萄糖；gatA，編碼雙功能的半乳糖基轉移酶，負責將1、2號半乳糖分別連接至4號庚糖；pcgA、pcgB、pcgC、pcgD形成磷酸膽堿(PCho)合成操縱子，協同將PCho轉移至半乳糖殘基。此外，部分1型血清型菌株，如X-73株的外核心寡糖還含有連接于1號半乳糖、2號半乳糖的磷酸乙醇胺殘基(圖2中用虛線表示)，但連接該基團所需的酶和基因目前尚不清楚[3，28]。血清型14與血清型1具有相同的外核心寡糖基因簇，唯一的區別是血清型14的pcgA基因存在19個堿基對的缺失，理論上這會導致外核心寡糖缺失2個PCho基團[21]，然而有趣的是，相比血清型1的外核心寡糖結構，血清型14還缺失2號半乳糖基團。同樣地，人為構建的VP161(血清型1)pcgC基因突變株也缺失2號半乳糖基團和2個PCho基團[12]，這表明gatA基因的作用依賴于PCho基團的完整性。當將相應的有功能的基因(pcgC、pcgA)分別回補至VP161pcgC突變株和血清型14 P2225株后，這兩種菌株均可表達與血清型1 VP161株相同的的外核心寡糖結構[12，21]。可見，單一基因的突變會造成外核心寡糖結構上的巨大差異。

圖2　外核心寡糖的化學結構及調控基因[30]Fig.2　The structures and required enzyme genes of the Pasteurella multocida LPS outer core structures [30]

血清型2、5的外核心寡糖基因簇屬L2型，包括4個糖基轉移酶基因，其中hptF、nctA、gatD基因僅存在于L2基因型中，為這兩個血清型獨有[20]。每個轉移酶的功能是通過將相應基因異源回補至VP161gatA突變株中并通過結構解析而鑒定的。血清型2、5的外核心寡糖結構相同，均由L-α-D-庚糖—D-α-D-庚糖—β-葡萄糖酰胺—β-D-半乳糖組成。而兩者LPS的唯一區別是血清型5內核心寡糖含有連接于2號庚糖的磷酸乙醇胺基團。基因測序發現，血清型2 M1404株的lpt_3基因無法表達。將有功能的lpt_3基因回補至M1404，回補株產生了與血清型5一樣的LPS結構，即包含連接于2號庚糖的磷酸乙醇胺基團[4]，這表明連接于2號庚糖的磷酸乙醇胺基團對血清型2、5 LPS的分型具有重要的意義。

在已知血清型3 Pm70株全基因組序列的基礎上[29]，通過對血清型3 P1059株，血清型4 P1662株的LPS進行定點突變和結構分析，確認合成了血清型3、4外核心寡糖所需的幾乎所有的糖基轉移酶及其編碼基因(除2號N-乙酰氨基半乳糖的轉移酶外)[22]。通過鑒定屬于L3基因型的23種菌株的外核心寡糖結構，人們發現L3中至少存在6種結構形式的外核心寡糖，它們具有長度不一的糖鏈[22]。例如血清型3 Pm70株會表達完整的外核心寡糖糖鏈，而血清型3 P1052株幾乎不表達最末端的2號N-乙酰氨基半乳糖。然而，由于沒有遺傳學證據表明基因型3部分表達短糖鏈菌株的外核心寡糖基因簇發生了突變，并且轉移2號N-乙酰氨基半乳糖基團的酶的功能不明確。因此，基因型3外核心寡糖糖鏈長度變化較大的原因尚未得到合理的解釋。相比于血清型3，血清型4外核心寡糖糖鏈長度較短，血清型4 P1662株糖鏈僅延伸至1號半乳糖基團，氨基酸測序發現P1662株gatG基因翻譯產物存在8個氨基酸的改變，這使得P1662株2號半乳糖轉移酶失活從而造成外核心寡糖糖鏈長度減短。

與其他大多數血清型不同，血清型6、7、16外核心寡糖的第一個糖(連接于內核心寡糖的1號葡萄糖)不是庚糖，而是半乳糖，并且這三種血清型外核心寡糖基因簇中不含有庚糖轉移酶基因[26]。通過質譜檢測和基因測序發現，血清型7natD和natE基因發生了突變，這可能導致了血清型7外核心寡糖糖鏈較血清型6缺少了一段四糖鏈：N-乙酰氨基半乳糖—N-乙酰氨基半乳糖—N-乙酰氨基半乳糖—半乳糖。血清型16外核心寡糖基因簇L8較為特殊，通過與其他血清型基因簇比對發現，L8型hetB基因與L4型natE基因在3′端具有94%的一致性，L8型gatM基因與L3型gatG、natB基因具有69%以上的一致性，人們推測L8型菌株可能是由L3、L4型菌株雜交而形成的[26]。血清型9的外核心寡糖基因簇(L5型)含有兩個較為罕見的糖，即鼠李糖和3-乙酰氨基-3，6-α-D-脫氧葡萄糖，且這兩種糖僅存在于血清型9的外核心寡糖[23]。

血清型8、13外核心寡糖合成所需大部分基因及其功能已經明確(除2-乙酰氨基-2-脫氧-D-半乳糖和甘油磷酸的轉移酶基因外)。同血清型8外核心寡糖糖鏈相比，血清型13外核心寡糖缺失了鏈末端的甘油磷酸基團，目前推測是由于合成甘油磷酸的ppgA、ppgB、ppgC基因中一個或多個基因發生突變所致[24]。此外，血清型10、11、12、15的外核心寡糖同屬L6，類似地，由于外核心寡糖基因簇中調控糖基轉移酶的nat_ps、hetA、gatJ、nctB等基因發生了突變或缺失，這4種血清型表達異質性的外核心寡糖結構，甚至血清型10不含有外核心寡糖結構[25]。

3　脂多糖與毒力

同其他革蘭陰性菌的LPS一樣，多殺性巴氏桿菌LPS具有內毒素活性，接種莢膜抗原B型菌的LPS后，水牛出現了典型的出血性敗血癥[31]。人們最早意識到LPS與細菌毒力相關是源于血清型12菌株的galE突變株在小鼠上完全減毒，GalE介導LPS組成成分UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖的轉換[32]。而驗證LPS與細菌毒力相關性的直接證據是兩個多殺性巴氏桿菌信號標簽誘變(signature-tagged mutagenesis，STM)文庫。第一個STM文庫的構建是將Tn5轉座子應用于致牛肺炎的TF5菌株上實現的，其中一個突變株在小鼠上的毒力顯著下降，序列分析證實突變發生于1個LPS合成相關的糖基轉移酶基因[33]，后來證實該突變基因為血清型3外核心寡糖基因簇中的gatG[29]。第二個STM文庫的構建是將Tn916轉座子應用于致禽霍亂的VP161菌株上實現的，突變發生于內核心寡糖相關基因的hptD突變株在雞上完全減毒，然而在小鼠上減毒不明顯，這表明LPS與毒力的關系在不同宿主上具有差異性[34]。隨著LPS合成相關基因的揭示[35]，人們進一步定向突變多個基因，發現LPS糖鏈的細微改變都有可能降低細菌的毒力，如僅僅缺失外核心寡糖PCho殘基會顯著降低VP161菌株對抗菌肽fowlicidin-1的抵抗力[12]；缺失內核心寡糖3號庚糖會導致1號葡萄糖的合成受阻并可顯著降低菌株在雞上的毒力[36]。在明確了血清型1 VP161株LPS合成相關的絕大部分基因的基礎上，人們對內、外核心寡糖合成基因(pcgC、gatA、hptE、gctB、gctA、hptC)進行了突變，敏感性試驗發現這些突變株對抗菌肽fowlicidin-1抵抗力的下降程度與LPS糖鏈的改變程度基本呈正相關[37]。綜上所述，多殺性巴氏桿菌LPS在細菌致病過程中發揮著重要的作用。

4　脂多糖與免疫

前期研究表明，多殺性巴氏桿菌LPS具有良好的免疫原性，免疫后產生特異性抗體能夠保護動物免受同源菌株的感染[38-40]。近期研究發現，基于血清型3菌株研制的疫苗免疫動物后能使動物產生針對血清型4菌株的交叉免疫保護力，反之亦然[4]；類似的，血清型5菌株的特異性抗體能夠抵抗血清型2菌株的感染[41]。這種交叉免疫保護的發生可能與LPS結構相關，血清型3和血清型4具有相似的LPS結構[22]，而血清型2和血清型5具有幾乎一致的LPS結構[20]。此外，多殺性巴氏桿菌滅活苗免疫動物后，能夠為雞提供保護力，而缺乏外核心寡糖的巴氏桿菌滅活苗則無法提供保護[42]。其次，研究發現來源于雞、山羊、水牛的多殺性巴氏桿菌的LPS存在于保守的B-細胞表位和T-細胞表位[43]。以上結果表明了LPS是多殺性巴氏桿菌的保護性抗原，其在疫苗研究領域具有重要的研究價值。

5　問題與展望

多殺性巴氏桿菌能夠造成多種動物的巴氏桿菌病，對世界畜禽業的發展造成了重大的經濟損失，盡管如此，多殺性巴氏桿菌的致病機制還十分不清楚。LPS是多殺性巴氏桿菌細胞膜的重要組分，研究其化學結構、合成基因有利于了解血清型劃分的分子基礎，建立新型的血清型鑒定方法及推動流行病學的發展。在這個基礎上，通過靶向LPS合成基因構建多種突變株則有利于解析LPS的作用機制，即化學結構與細菌毒力的關系，推動多殺性巴氏桿菌致病機制的研究。近期一種新型的鑒定血清型的PCR方法被建立，與傳統方法相比，這種方法更為準確、易操作，為流行病學調查提供了便利[30]。同時，研究發現LPS結構與細菌抵抗抗菌肽的能力、細菌毒力密不可分，甚至結構的細微改變(如PCho基團的缺失)便會顯著影響細菌對抗菌肽的敏感性，然而其中的作用機制還不清楚，加之此部分研究主要集中于血清型1菌株中，因而擴大血清型范圍，解析LPS合成相關的所有基因與細菌毒力的關系，以及多殺性巴氏桿菌表達兩種內核心寡糖的原因應成為未來研究的重要內容。此外，研究已證實一些全局調控基因參與LPS合成相關基因的表達調控，然而調控表達的生物學意義，即相關基因的調控表達是否改變了LPS的結構，以及修飾的結構對細菌的毒力有何影響尚不清楚，因而我們仍需通過篩選全局調控基因調控子、質譜分析、構建相應基因突變株等手段來解決這一重要的科學問題。

疫苗是疾病防控最經濟、有效的手段。LPS具有良好的免疫原性，其特異性抗體可介導針對同源菌株和LPS結構相似菌株的免疫保護，因而LPS應成為多殺性巴氏桿菌疫苗研究的重要研究對象。基于沙門菌的研究證實LPS的結構與免疫原性、免疫保護也有著密切的聯系，然而此部分研究尚未在多殺性巴氏桿菌上開展。因而，通過調控LPS合成相關基因，篩選低毒力、高免疫原性的LPS結構，以及解析相應結構與免疫保護之間的關聯應成為未來疫苗研究的重要內容。

綜上所述，LPS是多殺性巴氏桿菌細胞膜的重要組分，內核心寡糖具有A、B兩種型并具有保守性；外核心寡糖具有多樣性，某些血清型共享外核心寡糖基因簇，具有十分相似的外核心寡糖糖鏈。16種血清型內、外核心寡糖化學結構和合成基因的揭示使我們認識到LPS的生物學合成過程，并知曉LPS結構對細菌的毒力有著重要的影響，并將有助于人們基于LPS結構開發新型多殺性巴氏桿菌疫苗。

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(編輯白永平)

Research Progress in the Lipopolysaccharide ofPasteurellamultocida

HUA Rui-qi1，ZHAO Xin-xin1，2，3*，CHENG An-chun1，2，3*

(1.InstituteofPreventiveVeterinaryMedicine，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China；2.AvianDiseaseResearchCenter，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China；3.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

Pasteurellamultocida(P.multocida)，a Gram-negative cocco-bacillus，facultative anaerobic bacterium，is the causative agent of serious diseases in a wide range of animals.Lipopolysaccharide (LPS) is an important virulence factor，and is also a major immune protective antigen ofP.multocidawhich is currently classified into 16 Heddleston serovars based on LPS.Unlike the other Gram-negative pathogens，P.multocidaLPS is only made up of lipid A and core oligosaccharide，lacking an O-antigen.Recently，chemical structures and biosynthesis genes of 16 Heddleston serovars LPS have been determined by using mass spectrometry and gene sequencing.The inner core structures are highly conserved among different serovars，and genes required for the assembly of the inner core are located in several regions of the genome.In contrast，the outer core structures are distinct，and genes required for the biosythesis of the outer core structures are clustered in a single locus between the conserved genespriAandfpg.Some LPS serovars genetically have relationship each other，sharing the same outer core biosythesis locus，but producing different LPS molecules due to mutations within glycosyltransferase genes.Furthermore，LPS structures ofP.multocidaare related to bacterial virulence.Here，we summarize LPS structures，biosythesis genes and the relationships between LPS and bacterial virulence inP.multocida.

Pasteurellamultocida；lipopolysaccharide；chemical structures；biosynthesis genes；virulence

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.003

2016-05-20

國家現代農業(水禽)產業技術體系專項(CARS-43-8)；四川省應用基礎計劃項目(2015JY0244)

華瑞其(1994-)，男，江蘇常州人，本科生，動物醫學專業，主要從事鴨源多殺性巴氏桿菌核心寡糖合成基因與細菌生物學特性的研究, E-mail:Huaruiqi379@163.com

趙新新：Tel: 86-028-86291905，E-mail：xxinzhao@163.com；程安春：chenganchun@vip.163.com

R378.6

A

0366-6964(2016)10-1961-08