柞蠶免疫蛹粉在刺參健康養殖中的應用研究

孫永欣，溫志新，米銳，孟楠，馬淑慧，李學軍，李亞潔，都興范，李樹英

（遼寧省農業科學院大連生物技術研究所，遼寧大連116024）

水產養殖

柞蠶免疫蛹粉在刺參健康養殖中的應用研究

孫永欣，溫志新，米銳，孟楠，馬淑慧，李學軍，李亞潔，都興范，李樹英*

（遼寧省農業科學院大連生物技術研究所，遼寧大連116024）

體外誘導方法制備含有抗菌活性物質的柞蠶蛹粉，并將其以不同比例（0%、1.0%、2.0%）添加到刺參飼料中，并對照商品抗菌肽產品（0.5%添加），制成C、M1、M2和K幾種等能、等氮飼料，探討其在海參養殖中的應用可行性。結果發現，抗菌肽添加組（K）刺參的體增重率（82.06%）顯著高于對照組（C）（64.77%）（P＜0.05），M1組比對照組提高13.4%，但差異不顯著。免疫學指標測定中發現，刺參體腔細胞吞噬活性在各組間無顯著差異，但各添加組體腔液超氧化物歧化酶（SOD），M2、K組溶菌酶（LSZ）和M1、M2組酸性磷酸酶（ACP）活性與對照組相比均表現出顯著提高（P＜0.05），其中SOD活性M1、M2組和K組分別比對照組提高了40.24%、49.91%和61.49%；LSZ活性M2組和K組分別比對照組提高6.41%和5.48%；ACP活性，M1組和M2組分別比對照組提高了29.65%和37.34%。經體腔注射用燦爛弧菌（Vibrio splendidus）侵染各組健康刺參，三處理組刺參均表現出一定的對病原菌的抵抗力，但其中K組刺參的免疫保護率最高。電鏡切片顯示，柞蠶抗菌肽和免疫蛹粉可以提高小腸絨毛的長度，但2.0%免疫蛹粉則對小腸形態產生一定程度的破壞。綜上，飼料添加1.0%柞蠶免疫蛹粉可有效促進刺參生長，并提高抗病力。

刺參；柞蠶免疫蛹粉；生長；免疫；腸絨毛

刺參（Apostichopus japonicus），又稱仿刺參，作為高級滋補品和中醫藥膳，其被冠為肴品海八珍之首。隨著養殖技術的突破，刺參養殖業已成為中國北方沿海水產養殖的重要新興產業，取得了顯著的經濟和社會效益。但隨著養殖規模擴大，刺參的品質逐漸下降，良種匱乏，病害頻發，為了控制病情，在刺參育苗過程中大量使用抗生素。長期大量使用抗生素類藥物會造成一系列嚴重后果，其中最主要的是導致養殖水域生態環境污染和抗生素在養殖動物體內殘留，直接危害人類公共安全（Planas和Cunha，1999）。

柞蠶蛹經過一系列生物技術處理能夠自身產生抗菌物質（包括抗菌蛋白、抗菌肽、溶菌酶和凝集素等），統稱為柞蠶抗菌素（呂貴仁等，2011）。在柞蠶蛹誘導源研究中進一步發現，注射細菌、生理鹽水、某些化學物質均能誘導蛹體產生抗菌活性物質，它們種類基本一致，只是抗菌物質活性有所差異（周奇等，1988）。通過不同誘導源篩選表明，柞蠶鏈球菌誘導的抗菌物質活性高，且持續時間長（張春發等，1985）。目前，關于柞蠶蛹經誘導后作為抗生素替代品已在海珍品（都興范等，2000）和仔豬（李亞潔等，2016）上有了應用研究，但在海參養殖中鮮見報道。本試驗擬用柞蠶鏈球菌作為誘導源誘導柞蠶蛹體制備柞蠶免疫蛹粉，添加到海參飼料中，對比市售抗菌肽，探討免疫蛹粉對海參生長和免疫的影響，為拓展柞蠶資源綜合利用，開發海參免疫增強劑提供思路。

1　材料與方法

1.1飼料制備柞蠶免疫誘導蛹粉（IPP）由遼寧省農業科學院大連生物技術研究所制備得到。柞蠶抗菌肽產品（富力泰）由廣東海納川藥業股份有限公司生產。試驗原料以海泥、鼠尾藻、魚粉等為主要原料，分別添加0%（C）、1.0%（M1）、2.0%（M2）的IPP和0.5%的抗菌肽（K）制成4種等氮、等能試驗飼料，飼料配方及營養成分見表1。飼料原料的其他組分用粉碎機（DFY-500）粉碎至180目以上（粒徑為80 μm），用攪拌機（B10G）混合均勻后，加30%～40%的水，再次混合均勻，用制粒機擠壓成顆粒料（粒徑為1.8 mm），置于60℃烘箱中烘干，于-20℃冰箱中儲存備用。

1.2試驗設計與飼養管理試驗用刺參來自大連瓦房店市謝屯某育苗場，初始體重為（1.24± 0.41）g，暫養馴化7 d，期間投喂對照組飼料，直至刺參出現有規律的攝食和排便為馴化完成。挑選560只規格整齊、體色鮮亮、體質健壯的刺參進行試驗。

表1　試驗飼料組成及營養水平%

試驗于大連生物技術研究所水產動物養殖實驗室避光進行，刺參隨機分成4個處理，分別飼喂C、M1、M2和K飼料。每個處理設4個重復，每槽35只刺參，水槽體積為40 L。每天投餌一次，投餌量為刺參體重的3%～5%，根據刺參的攝食情況，相應調節投餌量，以幼參完全攝食并略有剩余為宜。每天換水一次，日換水量為1/2～1/3，同時清理糞便和收集殘餌，換水后投餌。每兩周徹底清理一次養殖水槽，試驗周期為60 d。試驗期間海水pH為7.9～8.4，養殖水溫16～19℃，鹽度為30～32‰。

1.3生長指標測定在試驗開始和結束時分別對各組刺參計數，并逐一稱量個體體重，稱量前幼參禁食24 h，于干凈培養皿靜置5 min，待其體腔內的水盡量排空后用電子分析天平（AL204，感量0.01 g）稱重。幼參增重率（WGR）、日增重率（WGPD）和特定生長率（SGR）、飼料系數（FC）計算公式如下：

式中：m0為刺參的平均初始體重，g；mt為刺參的平均終末體重，g；t為飼養時間，d；C為攝餌量（干重），g；W0為試驗刺參的初始體重，g；Wt為試驗刺參的終末體重，g。

1.4免疫指標測定飼養結束后，從每個水槽中隨機抽取3只刺參樣本，用注射器從刺參腹部近口處抽取體腔液，混于同一離心管中。體腔液樣本在4℃、5000 r/min離心10 min，移取上清，分裝到離心管中-20℃凍存，用于免疫指標測定。所有指標在24 h內完成分析。

1.4.1刺參體腔液超氧化物歧化酶活性測定體腔液中超氧化物歧化酶（SOD）的活力采用江蘇南京建成生物工程研究所生產試劑盒測定。體腔液SOD酶活性單位定義為每毫升體腔液中SOD抑制率達到50%時對應的SOD量為一個酶活性單位，U。

1.4.2刺參體腔液酸性磷酸酶活性測定體腔液中酸性磷酸酶（ACP）活性采用江蘇南京建成生物工程研究所生產試劑盒測定。體腔液ACP酶活力單位定義為100 mL體腔液在37℃與基質作用30 min產生1 mg酚為1個活力單位。

1.4.3刺參體腔液溶菌酶活力的測定體腔液中溶菌酶（LSZ）活性采用南京建成試劑盒空白對照法測定。體腔液LSZ酶活力單位定義：在37℃以每毫升刺參體腔液樣品每分鐘使吸光度降低0.001為一個酶活力單位。

1.4.4細胞吞噬率測定使用中性紅吞噬法測定各組刺參體腔細胞的吞噬活性（Sun等，2014）。每槽隨機取2個刺參樣本，抽取的刺參體腔液混于同一離心管中，用膠頭滴管反復吹打以充分混勻體腔液，無菌生理鹽水調整體腔細胞濃度為106個/mL體腔液；取100 μL體腔細胞懸液加入24孔細胞培養板中，孵育30 min；輕微振蕩，小心吸出未貼壁上清細胞懸液。加入100 μL 0.001 mol/L的中性紅溶液吞噬30 min；移除未被細胞吞噬的中性紅溶液，用無菌生理鹽水潤洗三遍；加入100μL細胞裂解液（1 mol/L HCL溶液4 mL加入無水乙醇96 mL，臨用前配制）以釋放吞噬細胞攝取的中性紅顆粒，裂解液處理20 min后，用分光光度計在540 nm波長處測量各組細胞裂解液的吸光度值。體腔液的細胞吞噬活性以540 nm波長下細胞裂解液的吸光度值計量。

1.5攻毒試驗飼養試驗結束后，從每個水槽隨機抽取個體大小均一的刺參15只，合并飼養于兩個40 L藍色聚乙烯水槽中，每槽30頭，對刺參進行14 d的燦爛弧菌攻毒試驗。攻毒試驗使用的燦爛弧菌（V.splendidus）為本研究所保存菌種，經擴增培養基在搖床25℃、140 r/min培養24 h，用無菌生理鹽水沖洗菌落，調整菌液濃度為5.0×108cfu/mL。菌懸液用1 mL無菌注射器注射到刺參體腔中，每只刺參注射0.2 mL菌液，將注射后1 h內即吐臟的刺參記為死亡。攻毒期間對刺參投喂少量基礎飼料，及時記錄刺參死亡和吐臟數目，攻毒試驗結束后，統計刺參的累積死亡率，并計算免疫保護率。

其中，D0和Dt分別為攻毒過程中刺參初始只數和累積死亡只數。

1.6刺參腸道上皮細胞形態電鏡觀察試驗使用透射電鏡（TEM）觀察各處理組和對照組刺參腸道上皮細胞結構。在養殖試驗結束后，取各組刺參，解剖取出腸道，將中腸和后腸剪成小段于安剖瓶中2.5%戊二醛固定，4℃保存。透射電鏡樣品制備過程如下：先將戊二醛固定好的腸道小段樣品經1%鋨酸后固定，再由乙醇系列濃度脫水，Epon 812環氧樹脂包埋，E型超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色，最后選取有代表性的視野用JEM-1200EX型透射電鏡觀察拍照。

1.7數據分析試驗數據以“平均值±標準差”表示。采用SPSS 17.0進行單因素方差分析，用Duncan’s多重法比較各組間平均值的差異顯著性，P＜0.05為顯著性差異。

2　結果

2.1柞蠶抗菌肽和免疫誘導蛹粉對刺參生長的影響養殖試驗期間，各組海參沒有死亡現象，增重率情況如表2所示。由表2可見，飼養結束后，刺參的增重率和特定生長率以添加柞蠶抗菌肽組（K組）最高，增重率分別比對照組和M2組提高43.69%和49.55%，均達到顯著水平（P＜0.05），其次是M1組，增重率比對照組提高13.4%，但與對照組無顯著差異（P＞0.05）。各組特定增長率（SGR）與增重率表現出一致的結果。

表2　柞蠶抗菌肽和免疫誘導蛹粉對刺參生長的影響（n=4）

2.2柞蠶抗菌肽和免疫誘導蛹粉對刺參體腔液免疫指標的影響由表3可見，刺參體腔液吞噬細胞的吞噬活性各組間沒有顯著性差異（P＞0.05）；SOD活性，M1、M2和K組分別比對照組提高40.24%、49.91%和61.49%，均達到顯著差異水平（P＜0.05），其中K組顯著高于M1組和M2組；LSZ活性表現為M2、K組顯著高于對照組和M1組（P＜0.05），其中M2組比對照組提高6.41%，K組則提高5.48%；體腔液ACP活性，M1組和M2組顯著高于對照組（P＜0.05），各提高了29.65%和37.34%，K組酶活性也明顯高于對照組。

表3　柞蠶抗菌肽和免疫誘導蛹粉對刺參體腔液免疫指標的影響（n=4）

2.3柞蠶抗菌肽和免疫誘導蛹粉對刺參抵抗病菌侵染的影響燦爛弧菌侵染對刺參累計死亡率和免疫保護率的影響表明，攝食添加柞蠶抗菌肽的刺參累計死亡率最低（13.33%），免疫保護率最高（46.67%）；免疫誘導蛹粉也能降低刺參被病菌侵染后的死亡率，但沒有抗菌肽效果明顯（表4）。

表4　柞蠶抗菌肽和免疫誘導蛹粉對刺參抵抗燦爛弧菌侵染的影響（n=60）

2.4柞蠶抗菌肽和免疫誘導蛹粉對刺參腸道上皮細胞形態的影響通過透射電鏡圖比較刺參中腸和后腸上皮細胞形態以及內部細胞器種類和數量發現，刺參中腸上皮細胞的狀態與后腸上皮細胞相差極大，中腸上皮細胞微絨毛密集且較長，細胞中線粒體數量多，細胞間排列緊密；后腸細胞微絨毛稀疏而短，胞內線粒體少，細胞近微絨毛端有破損。各處理組中，2.0%免疫蛹粉表現出較為明顯的對腸道細胞的破壞作用（表5和表6）。

表5　柞蠶抗菌肽和免疫蛹粉對刺參中腸上皮細胞的影響

表6　柞蠶抗菌肽和免疫蛹粉對刺參后腸上皮細胞的影響

3　討論

抗菌肽對畜禽和水產動物均具有一定的生長促進作用。姜珊等（2011）對富吉羅非魚的研究結果表明，在一定添加水平內，重組抗菌肽能顯著提高羅非魚的存活率、增重率和特定生長率。在本試驗中，抗菌肽組和1.0%免疫蛹粉組都呈現出對刺參的促生長作用。然而夏耘等（2012）發現，飼料中添加抗菌肽對花鱸生長和存活率均無顯著影響，溫劉發等（2007）也認為抗菌肽制劑對斷奶仔豬的增重無顯著影響，過量添加反而會對仔豬生長不利。這說明抗菌肽對動物生長的影響可能會因飼養動物種類、發育階段和養殖環境的不同而存在差異。本研究中也發現，當柞蠶免疫蛹粉添加量達到2.0%時，刺參的增重率與對照組相當，可能是因為蛹粉含量過高，導致飼料中營養成分出現不均衡，這與桑蠶粉替代魚粉用于海參養殖研究中的結果類似（Sun等，2014）。

刺參體腔液細胞的吞噬活性各組間雖沒有表現出顯著性差異，但容易發現，在攝食M1組、M2組和K組飼料的刺參，體腔液中細胞的吞噬活性相比對照組都有增高的趨勢。這可能與柞蠶抗菌肽和免疫誘導蛹粉的使用劑量和投喂時間長短有關。在刺參的體壁防御和體內免疫中，SOD、LSZ和ACP都發揮著重要的作用。各免疫指標比較而言，刺參體腔細胞吞噬活性、體腔液LSZ、ACP活性均是M2組刺參最高，唯獨體腔液SOD活性是K組刺參更高，這說明體腔液SOD活性是直接與抗菌肽含量相關的。何義進等（2011）研究顯示，日糧中添加0.1%～0.4%的抗菌肽能有效提高異育銀鯽的抗氧化能力。白燕等（2012）研究結果表明，用蠅蛆粉替代魚粉能顯著提高刺參體腔液ACP、T-SOD、LSZ和堿性磷酸酶（AKP）活性，這些研究與本試驗所得結論相近。本試驗中，刺參體腔液ACP活性三個處理組均顯著高于對照組（P＜0.05），M2組和M1組的酶活性又明顯高于K組。這說明柞蠶抗菌肽對刺參具有一定的免疫刺激作用，而免疫誘導蛹粉中非抗菌肽成分能更為強烈地刺激刺參體腔液ACP活性，其機理尚有待探討。試驗結果還表明，刺參體腔液ACP水平與體腔細胞吞噬活性和LSZ活性都存在一定程度的關聯，這可能正是ACP在海參免疫系統中調理作用的體現。

燦爛弧菌是刺參腐皮綜合癥的致病菌，對刺參的養殖危害嚴重。通常，被燦爛弧菌感染的刺參表現為軀體收縮、停止攝食，并伴有搖頭、口腫、皮膚潰爛的現象出現（Wang等，2004；Bertheussen，1982）。本試驗對受感染刺參的觀察也發現了上述表征。總體來看，柞蠶抗菌肽攝食組刺參的免疫保護率最高，免疫蛹粉也能增強刺參對燦爛弧菌的抵抗能力，說明兩者通過攝食途徑能夠調節刺參機體的免疫水平，但是機制還需進一步研究。

小腸是動物營養吸收的主要部位之一，動物消化的絕大部分營養物質在小腸部位被吸收。王靜等（2007）研究表明，豬小腸抗菌肽能顯著提高肉雞腸道絨毛長度和腸絨毛長度與隱窩深度的比值，從而改善雞十二指腸和空腸的消化吸收功能，提高肉雞生產性能。郭志強等（2012）也發現，抗菌肽能夠顯著提高肉兔空腸絨毛高度以及腸絨毛與隱窩深度的比值。在水產動物，鮮見抗菌肽調節腸道上皮細胞形態的研究。在對水產動物前后腸絨毛的研究中，方靜等（1997）觀察表明，齊口裂腹魚腸上皮吸收細胞微絨毛長而密，線粒體和內質網豐富，存在發育良好的高爾基體；而后腸微絨毛稀而短，核上區線粒體和內質網較少，這與本試驗對刺參的觀察描述相似，這種結構特征可能意味著，刺參的前、中腸消化吸收及合成分泌功能比較強，后腸則較弱。本研究中對不同處理對刺參中腸和后腸影響的觀察發現，M2組刺參后腸微絨毛及細胞結構有所破壞，細胞近腸腔端破裂，細胞質和細胞器外流，對中腸的觀察發現，三個處理組的腸上皮細胞微絨毛長度明顯比對照組更高，而M2組線粒體數量明顯變少，說明刺參中腸對免疫蛹粉營養物質的吸收轉運效果較差，這與M2組刺參增重率較低存在一定的聯系。大量研究都表明，食物成分能通過改變腸道菌群來破壞魚類腸道細胞形態結構。用豆粕替代50%的魚粉飼喂虹鱒，會引發其腸炎疾病，表現為腸上皮微絨毛損壞，后腸微絨毛顯著短于前腸，密度也較飼喂魚粉組稀疏，此外，黏附在腸微絨毛的細菌也會因絨毛密度的稀疏而減少，進而導致腸上皮緊致連接暴露，腸細胞壞死，使腸上皮屏障作用減弱（Cociancich等，1994）。對本試驗而言，抗菌肽能明顯提高刺參的增重率并增加中腸細胞微絨毛高度和細胞轉運吸收能力，柞蠶免疫蛹粉同樣含有抗菌類蛋白以及免疫活性物質，但其卻呈現出抑制刺參生長的效果，這可能是蛹粉中的營養物質與刺參營養需求和攝食生理不匹配造成的，營養成分的改變導致腸道菌群發生移位，弧菌由前中腸轉移到本應存在量很少的后腸，滋生并破壞上皮細胞，侵染機體，致使刺參免疫酶活性持續表達，從而影響刺參生長。M2組的數據與這一推斷是較為吻合的，但具體的原因必須要進行更嚴格地試驗設計和推敲才能知曉。

4　小結

在本試驗條件下，飼料中添加柞蠶免疫蛹粉對刺參的生長指標影響不顯著，但是能提高刺參免疫力并提高刺參對致病性燦爛弧菌的抵抗力，此外，添加1.0%柞蠶免疫蛹粉能提高刺參小腸絨毛長度，如升至2.0%則對小腸形態有一定程度破壞。可見，添加1.0%柞蠶免疫蛹粉可有效提高刺參免疫力和抗病力，且對刺參生物體無損害。

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Immunity induced pupae of Antheraea Pernyi powder（IPP）was produced by our institute，and supplemented into basic diets of sea cucumber with the different levels（0%，1.0%and 2.0%），simultaneously 0.5%merchandise antimicrobial peptides was used as a refer.Four isonitrogenous and isoenergic diets contained different levels of IPP and antimicrobial peptides were formulated named group C，M1，M2 and K，respectively.After 60 days feeding trail，growth performance，immunity，disease-resistance and intestinal epithelial cells of sea cucumber with average weight of（1.24±0.41）g were investigated to discuss its feasible application in sea cucumber culture.Results showed that the weight gain rate of group K（82.06%）adding antimicrobial peptides was significantly higher than that of group C（64.77%）（P＜0.05）.Although group M1 increased by 13.4%than the control，no significant difference was found.As to the immunological parameters，no significant difference of phagocytic activity of coelomic cells was observed among groups，while activities of superoxide dismutase（SOD）of all treated groups，lysozyme（LSZ）of groups M2 and K，and acid phosphatase（ACP）of groups M1and M2 were all significantly higher than that of the controls（P＜0.05）.Among them，the SOD of activity group M1，M2 and K increased by 40.24%，49.91%and 61.49%，respectively；the LSZ activity of group M2 and K increased by 6.41%and 5.48%，respectively；while the ACP activity of group M1 ang M2 was found 29.65%and 37.34%higher than that of the control.Infectious disease test showed that sea cucumber of three treated groups presented resistance against pathogenic bacteria to an certain extent，while group K showed the highest immune protection rate.An electron microscopic study was undertaken to investigate the effect of dietary IPP and antimicrobial peptides on intestinal villi and their villi promoting effect exhibited，however，2.0%IPP showed some damage to intestinal villi.From the above，1.0%IPP supplemented in the basic diets could increase growth performance and disease resistance of the sea cucumber in the study.

Apostichopus japonicus；immunity induced pupae of Antheraea Pernyi powder；growth；immunity；intestinal epithelial cells

資源開發利用

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161505

S963

A

1004-3314（2016）15-0019-05

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD16B09-1）；現代農業產業技術體系建設專項（CARS-22）；遼寧省重大科技攻關項目（2014209001）