苜蓿粉發酵用乳酸菌的篩選及特性研究

楊慧曉，王雁萍，郭琳娜，趙珊珊，楊逢源

（河南省離子束生物工程省重點實驗室，河南鄭州450052）

資源開發利用

苜蓿粉發酵用乳酸菌的篩選及特性研究

楊慧曉，王雁萍*，郭琳娜，趙珊珊，楊逢源

（河南省離子束生物工程省重點實驗室，河南鄭州450052）

為篩選調制優質動物苜蓿青貯飼料的優良乳酸菌，本試驗以從鄭州地區9個苜蓿樣品中分離得到的乳酸菌為試驗材料，經抗菌活性、生長特性及產酸特性篩選菌株，根據16S rDNA序列，結合生理生化特征進行菌種鑒定，并通過發酵苜蓿粉考察菌株的發酵特性。結果表明，從分離的19株乳酸菌中篩選到4株具有高抗菌活性的菌株，其中菌株ZZU 457和ZZU 466在MRS液體培養基中生長及產酸性能較好，均能夠耐受6.5%的鹽濃度環境；菌株ZZU 457耐受10～45℃，以及pH為3.5的環境，而菌株ZZU 466能夠耐受5～50℃，以及pH為4.0的環境；苜蓿粉發酵結果表明接種ZZU 457或ZZU 466在發酵18 h內均能快速產酸，其中接種ZZU 466的苜蓿粉發酵36 h時pH值達到4.2；結合理化特征及16S rRNA序列分析結果，ZZU 466被鑒定為融合魏斯氏菌。優良菌株ZZU 466在苜蓿青貯飼料調制加工中具有潛在的應用價值。

苜蓿粉；發酵；乳酸菌；篩選；特性

苜蓿作為一種優質豆科飼草，其蛋白質含量高，且營養成分豐富，對奶牛飼喂和肉牛增重方面效果顯著。在我國主要苜蓿種植區，由于雨淋、落葉等因素引起的損失高達30%，將其進行青貯可明顯避免這些損失，且能促進家畜對其消化（王永新等，2012）。然而刈割期的苜蓿由于緩沖度高、可溶性糖分低及表面自然附著的乳酸菌較少等特征使其青貯較難（李改英等，2010）。相關研究表明，使用優良乳酸菌作為青貯添加劑，對改善苜蓿青貯飼料品質有顯著效果（許慶方，2005）。本研究從鄭州地區苜蓿自然附生乳酸菌中篩選適合苜蓿粉發酵的優良菌株，以期為開發用以調制優質動物苜蓿青貯飼料的乳酸菌添加劑提供理論依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1材料新鮮的紫花苜蓿（取自鄭州地區）自然晾干后于65℃烘箱烘48 h，用高速粉碎機制成粉末，過40目篩并置于4℃冰箱中保存備用。

1.1.2培養基MRS液體培養基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸銨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 L，pH 6.5。

NA培養基（用于沙門氏菌、大腸桿菌、李斯特菌的培養）：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

半固體培養基：配方同NA培養基，瓊脂含量為0.8%。

1.1.3儀器設備722型可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；臺式酸度計（奧豪斯）；PTC-200 PCR儀；GelDoc-XR凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司。

1.2試驗方法

1.2.1乳酸菌的分離和純化將新鮮苜蓿樣品切成小塊，取10 g樣品加入90 mL無菌水中，搖勻即為稀釋10倍的樣品懸液，按照10-6～10-2的梯度進行稀釋，取適當濃度菌液20 μL涂布在固體MRS平板上，置于30℃厭氧培養箱中，培養48 h后計數，并挑選典型菌落分離純化直到經革蘭氏染色為陽性、鏡檢結果為單純菌株時再進行過氧化氫酶試驗。凡是革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性的菌株即可初步確定為乳酸菌，將其接種到MRS固體斜面上，4℃冰箱中保存備用。

1.2.2無細胞上清液的制備將純化的19株乳酸菌，按2%的接種量分別接種于1 mL MRS液體培養基中，30℃條件下培養48 h后，4℃、12000 g離心（10 min）獲得上清液，并用0.22 μm微孔濾膜過濾得到無細胞發酵上清液。

1.2.3抑菌活性測定選取大腸桿菌、沙門氏菌及單核增生李斯特菌作為指示菌，采用雙層牛津杯抑菌法對19株乳酸菌進行抑菌篩選。取10 mL指示菌菌懸液（濃度約106～107cfu/mL）均勻涂布于NA半固體平板上，牛津杯放置在上層指示菌培養基上。加入200 μL發酵上清液于牛津杯，37℃培養恒溫培養24 h，用游標卡尺測定抑菌圈直徑。

1.2.4生理生化、產酸特性測定及生長曲線繪制通過形態、革蘭氏染色、過氧化氫酶等試驗及設置不同的溫度、pH和鹽濃度條件分析乳酸菌的生理生化特性，生長特性及產酸特性。均按2%的接種量將篩選菌株的菌液接種到100 mL液體MRS培養基中，每2 h取樣測定pH值及波長為600 nm處的吸光度值，并分別將不同時間的pH值及OD值繪制成產酸曲線和生長曲線（Pang等，2011）。

1.2.5苜蓿粉的發酵特性將經抗菌活性、生長特性及產酸特性篩選的乳酸菌接種到40%的苜蓿粉漿中，每隔6 h取樣1 g，加9 mL蒸餾水，充分混勻，測定pH值，并繪制產酸曲線。

1.2.616s rDNA序列測定通過CLUSTAL W軟件將菌株的16S rDNA序列與在GenBank中檢測得到的標準菌株序列信息進行比對，采用鄰接法構建系統發育樹，并用枯草芽孢桿菌Bacillus. subtilis作外圍菌株（Ni等，2015）。

2　結果與分析

2.1高抗菌活性乳酸菌的篩選從鄭州地區的9個苜蓿樣品中，分離到19株乳酸菌。通過對三種指示菌的抑菌試驗，篩選到4株高抗菌活性的乳酸菌。由表1可見，菌株ZZU 456、ZZU 457和ZZU 473對大腸桿菌的抑菌活性均較高；菌株ZZU 457、ZZU 466和ZZU 473對李斯特菌的抑菌活性均較高；菌株ZZU456、ZZU 457和ZZU 466對沙門氏菌的抑菌活性均較高。

表1　篩選菌株的抑菌活性

2.2生長特性篩選得到的4株高抗菌活性乳酸菌在MRS液體培養基中的生長曲線見圖1。由圖1可見，4株乳酸菌的生長趨勢較為一致，發酵0～10 h，處于對數生長期，均明顯呈現出快速生長趨勢；發酵10～20 h，進入生長穩定期；發酵20 h后，進入衰亡期。在發酵2～48 h，菌株ZZU 457和ZZU 466的生物量均明顯高于菌株ZZU 456和ZZU 473。

2.3產酸特性篩選得到的4株高抗菌活性乳酸菌在液體MRS培養基中的產酸曲線見圖2。由圖2可見，與不接種的自然發酵相比，發酵0～48 h，接種乳酸菌的發酵液pH值均明顯下降，且在0～12 h下降速度較快，其中接種菌株ZZU 457和ZZU 466的發酵液pH值均明顯低于菌株ZZU 456和ZZU 473。

圖1　篩選菌株的生長曲線

圖2　篩選菌株的產酸曲線

2.4生理生化特征菌株ZZU 457和ZZU 466的生理生化特征見表2。由表2可見，兩株菌均呈短桿狀、革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性，且均為同型發酵類型，能夠耐受3.5%～6.5%的鹽濃度環境；在溫度為5℃和50℃環境中，菌株ZZU 457僅能夠微弱生長，而菌株ZZU 466均能夠良好生長；菌株ZZU 457微弱耐受pH為3.0的環境，能夠耐受pH為3.5的環境，菌株ZZU 466微弱耐受pH為3.0和3.5的環境，能夠耐受pH為4.0的環境。

表2　乳酸菌的生理生化特征

2.5發酵苜蓿粉特性菌株ZZU 457和ZZU 466在苜蓿粉中的產酸曲線見圖3。由圖3可見，與自然發酵相比，接種乳酸菌的苜蓿粉pH值在0～54 h均明顯降低，在0～12 h時下降速度均較快，在36 h時均達到最低。與接種菌株ZZU 457相比，接種ZZU 466的苜蓿粉pH值在2～54 h時較低，且在36 h時達到最低，為4.2。

圖3　乳酸菌發酵苜蓿粉的pH值

2.6菌種鑒定優良乳酸菌ZZU 466在形態學上呈短桿狀、乳白色，結合其在系統進化樹上的位置，初步被鑒定為融合魏斯氏菌，圖4為該菌株的系統進化樹。

圖4　優良菌株的16S rRNA基因序列系統進化樹

3　討論

本研究發現，與接種菌株ZZU 466相比，接種ZZU 457在MRS液體培養基中發酵8 h后的生物量較高，發酵液pH值較低，且能夠耐受pH為3.5的酸性環境，然而在苜蓿粉中發酵8 h后發酵液的pH值卻較高。說明在MRS培養基中生長較好且產酸較多的乳酸菌不一定在苜蓿粉發酵過程中產酸較多。Muck（1989）報道，并不是所有乳酸菌都能對苜蓿材料發揮較好的作用，可能是因為添加的菌株在目標作物上不易生長或不生長。為了保證添加劑的有效活力，避免菌種因為作物營養或與其他微生物之間的競爭等因素引起的對環境條件的不適應，應該有針對性地篩選適于苜蓿青貯的乳酸菌。本試驗篩選的優良乳酸菌ZZU 466不僅具有較好的抗菌活性，而且在發酵苜蓿粉過程中產酸性能較好，將有望被開發為苜蓿青貯添加劑，用以調制優質動物苜蓿青貯飼料。

4　結論

4.1本試驗從鄭州地區9個苜蓿樣品中分離到的19株乳酸菌中，篩選到4株對指示菌如大腸桿菌、沙門氏菌和李斯特菌抗菌活性均較好的菌株。

4.2乳酸菌ZZU 457和ZZU 466在MRS培養基中生長較好且產酸較多，發酵苜蓿粉性能較好，其中菌株ZZU 466發酵苜蓿粉性能優于菌株ZZU 457。

4.3菌株ZZU 466能夠耐受6.5%的鹽濃度，耐受5～50℃溫度環境及pH 4.0的酸度環境，被鑒定為融合魏斯氏菌。

［1］李改英，高騰云，傅彤，等.影響苜蓿青貯的因素及其青貯技術的研究進展［J］.動物營養與飼料科學，2010，37（12）：22～26.

［2］王永新，蒙淑芳，許慶方，等.淋雨和添加劑對苜蓿青貯品質的影響［J］.草地學報，2012，20（3）：565～570.

［3］許慶方.影響苜蓿青貯品質的主要因素及苜蓿青貯在奶牛日糧中應用效果的研究：［博士學位論文］［D］.北京：中國農業大學，2005.

［4］Muck R E．Effect of inoculation level on alfalfa silage quality［J］.Transactions of the ASABE，1989：32（4）：1153～1158.

［5］Ni K K，Wang Y P，Li D X.Characterization，identification and application of lactic acid bacteria isolated from forage paddy rice silage［J］.PloS ONE，2015，10（3）：1～14.

［6］Pang H L，Zhang M，Qin G Y.Identification of lactic acid bacteria isolated from corn stovers［J］，Animal Science Journal，2011，82（5）：642～653.

The purpose of this research was to screen high quality lactic acid bacterias for alfalfa silage.9 alfalfa samples of Zhengzhou area were selected by comparing of their antimicrobial activity or growth features and acid production features.Stains of the ideal samples were identified according to the sequence of 16S rDNA and the physiological and biochemical characteristics.The fermentation features of alfalfa meal for the excellent strains were also studied.We got 4 lactic acid bacterias that performed a higher activity to inhibit of indicator bacterias.Only ZZU 457 and ZZU 466 of 4 strains showed high rate of growth and acidification in MRS liquids.ZZU 457 could tolerant temperature of 10～4.5℃and low pH environment（pH 3.5）.Strain of ZZU 466 could survive in temperature of 5～50℃and low pH environment（pH 4.0）. Results of the alfalfa meal fermentation indicated that both two strains could produce acid quickly within 18 hours，especially for strains of ZZU 466.It could reduce the pH to the lowest value of 4.2 for the alfalfa meal fermentation liquids at 36 hours.According to the physiological and biochemical test，analysis of the 16S rRNA sequence identified that this strains was W.corfusa.The strain of ZZU 466 had potential value of application as an additive in alfalfa silage.

alfalfa；fermentation；lactic acid bacteria；screening；characteristics

S816.7

A

1004-3314（2016）12-0035-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161209

河南省重點科技攻關項目（152102110045、152102310064）；河南省基礎與前沿技術研究項目（162300410131）；鄭州大學研究生教學改革項目（YJSJY201407）