特應性皮炎患者外周血T淋巴細胞Rho激酶活性變化及其意義

梁穎紅 魏明 涂玲 劉佳 龔艷杰 張宜花

450052鄭州大學附屬第五臨床學院檢驗科

特應性皮炎患者外周血T淋巴細胞Rho激酶活性變化及其意義

梁穎紅 魏明 涂玲 劉佳 龔艷杰 張宜花

450052鄭州大學附屬第五臨床學院檢驗科

目的 觀察特應性皮炎（AD）患者外周血T淋巴細胞中Rho激酶活化情況，分析其臨床意義。方法 收集60例AD患者和60例健康兒童外周肝素抗凝血8 ml，分離提取T細胞和血清。分別用AD血清和健康對照血清培養AD患者T細胞或健康對照T細胞，分為患者T細胞+自身血清組、患者T細胞+健康對照血清組、健康對照T細胞+自身血清組、健康對照T細胞+AD血清組。此外，分別用Rho激酶特異性抑制劑Y27632（Y27632組）、CD3/CD28單抗（CD3/CD28單抗組）、Y27632+CD3/CD28單抗（Y27632+CD3/CD28單抗組）處理AD患者T細胞，自身血清培養AD患者T細胞為患者T細胞組。采用Western印跡法檢測各組Rho激酶活性，四甲基偶氮唑藍比色法（MTT）檢測T細胞增殖活性，ELISA檢測白細胞介素（IL）6、IL-10水平。結果新鮮分離的AD患者外周血T細胞Rho激酶活性（2.47%±0.89%）顯著高于健康對照組（0.65%±0.35%，t=2.729，P＜0.05）。AD患者T細胞在體外經10%胎牛血清培養24 h后Rho激酶活性（0.70%±0.38%）較培養前顯著降低（t=2.658，P＜0.05），但與培養24 h后健康對照T細胞（0.63%±0.32%）相比，差異無統計學意義（t=1.010，P＞0.05）。與健康對照血清培養T細胞相比，AD血清培養T細胞會增加Rho激酶活性（F=8.22，P＜0.001），患者T細胞+自身血清培養24 h后Rho激酶活性（2.41%±0.87%）明顯高于患者T細胞+健康對照血清組（0.76%±0.41%），健康對照T細胞+AD血清組（2.17%±0.85%）顯著高于健康對照T細胞+自身血清組（0.64%±0.33%），差異均有統計學意義（P＜0.05）。Y27632可顯著抑制AD患者T細胞的增殖和IL-6的分泌（F=18.68、22.95，P＜0.001），Y27632組T細胞增殖率、IL-6的表達均顯著低于患者T細胞組（均P＜0.05），且Y27632+CD3/CD28單抗組也顯著低于CD3/CD28單抗組（均P＜0.05），而Y27632對AD患者T細胞IL-10分泌無顯著影響。結論 AD患者T淋巴細胞存在Rho激酶信號活化異常，提示Rho激酶信號異常在AD發病過程中可能發揮著一定的作用。

皮炎，特應性；T淋巴細胞；rho相關激酶類；信號傳導；白細胞介素6；白細胞介素10

在特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）的發病機制中，T細胞活化可能起著關鍵性的作用［1-3］，活化的T細胞通過分泌細胞因子和（或）細胞間相互接觸等方式啟動B細胞多克隆活化和擴增，導致高球蛋白血癥和自身抗體過度產生，參與局部炎癥反應。研究［4-7］發現，T細胞中存在多種信號蛋白活性異常，并且這些異常的信號蛋白可能參與了AD的發病機制。Rho激酶（Rho kinase）是小分子鳥嘌呤核苷（GTP）酶Rho A信號下游的一個關鍵性蛋白，不僅參與調節細胞骨架形成、遷移等細胞活動，而且對細胞增殖、免疫炎癥反應也有重要的調控作用［8-10］。據文獻［11］報道，Rho 激酶特異性抑制劑 Y27632能顯著抑制人外周T細胞分泌白細胞介素（IL）-2、干擾素（IFN）-γ等細胞因子，提示Rho激酶可能參與T細胞活化。但Rho激酶是否參與AD的發病機制目前尚不清楚。為此，我們觀察了AD患者外周血T細胞Rho激酶活性，探討其臨床意義。

對象與方法

一、對象

2011年10月至2014年12月就診于我院門診的AD患者60例，全部符合Williams特應性皮炎診斷標準［12］，其中男 24例，女 36例，年齡 5～14（10.0±4.6）歲。所有患者均無其他明顯皮膚病變、自身免疫性疾病、心血管疾病、神經系統疾病、內分泌系統疾病、呼吸系統疾病、肝病和腫瘤等病史，且停用抗組胺藥2周以上，停用系統及局部糖皮質激素及其他免疫抑制劑1個月以上。健康對照組60例來自兒保科健康體檢者，其中男26例，女34例，年齡 5～14（10.0±4.5）歲，無家族過敏史，無明顯皮膚病變或內臟疾病史。兩組受試者性別、年齡差異無統計學意義。本實驗經醫院倫理委員會批準，兒童法定監護人均簽署知情同意書。

二、方法

1.材料和試劑：RosettSep T細胞提取試劑盒（加拿大Stemcell Technologies公司），含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基（美國Gibco公司），抗CD3單抗（美國BD Pharmingen公司），CD3單抗、CD28單抗（美國BD Biosciences公司），Rho激酶特異性抑制劑Y27632（美國Chemicon公司），1∶500磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亞基1（MYPT-1）、1∶2 000辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠IgG（美國Santa Cruz公司）。十二烷基硫酸鈉（SDS）樣本裂解緩沖液A由50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、10 mmol/L MgCl2、500 mmol/L NaCl、1%Triton X-100、0.5%去氧膽酸鈉、0.1%SDS、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、10 mg/L亮抑肽酶、10 mg/L抑肽酶配制而成。

2.標本收集及外周血T細胞分離：抽取AD患者和健康對照組兒童外周靜脈血8 ml，均分裝2管。一管5 ml抗凝血用于T細胞分離，采用RosettSep T細胞提取試劑盒分離T淋巴細胞，然后用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基重懸，調整T細胞密度1×109，分別把懸液置于 96孔板（100 μl/孔），37℃、5%CO2孵箱中培養24 h，用抗CD3單抗在流式細胞儀上檢測T細胞純度，均在95%以上。采用免疫印跡法檢測AD患者和健康對照組外周血T細胞培養前后Rho激酶活性。另一管3 ml血液1 500×g離心5 min，吸取上清液，分裝儲存于－80℃待用。

3.AD患者血清對T細胞的影響：使用前，AD患者和健康對照血清均在56℃滅活30 min，然后離心除去沉淀物。隨機將血清和T細胞分為患者T細胞+自身血清組、患者T細胞+健康對照血清組、健康對照T細胞+自身血清組、健康對照T細胞+AD血清組，培養24 h后，檢測各組Rho激酶活性。

4.免疫印跡法檢測Rho激酶活性：提取各組T細胞總蛋白：用冷1×PBS洗滌T細胞1次，加入50 μl SDS樣本裂解緩沖液A，勻漿后置冰上，超聲粉碎10～15 s，于95～100℃煮5 min，然后置冰上；4℃1 600×g離心5 min，吸取上清液，分裝儲存于-20℃。采用免疫印跡法檢測磷酸化MYPT-1蛋白表達（用磷酸化MYPT-1蛋白表達來表示Rho激酶活性）。取50 μl T細胞總蛋白上樣于15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，用轉移緩沖液把凝膠上蛋白質轉移至醋酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h。然后膜與I抗（1∶500磷酸化MYPT1）于4℃孵育過夜，β肌動蛋白（1∶2 000）為內參，后在室溫下與Ⅱ抗（1∶2 000辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠IgG）孵育1 h，TBST洗膜后，用ECL液顯影，最后用KODAKID型凝膠成像分析系統對結果進行圖像分析，Rho激酶活性=磷酸化MYPT-1A值/β肌動蛋白A值。

5.Y27632對AD患者T細胞的影響：將已分離的部分AD患者T細胞分為患者T細胞組（不進行任何處理）、CD3/CD28單抗組（用5 mg/L CD3單抗和5 mg/L CD28單抗處理AD患者T細胞）、Y27632組（用 10 μmol/L Y27632處理 T細胞）、CD3/CD28單抗+Y27632組（先用Y27632處理T細胞，再用CD3/CD28單抗刺激）。處理48 h后，提取各組T細胞總蛋白，檢測各組T細胞增殖活性和T細胞培養上清液中IL-6和IL-10水平。采用噻唑藍（MTT）法測定T細胞增殖活性，MTT法具體步驟參見文獻［13］。按ELISA試劑盒步驟檢測T細胞培養上清液中IL-6和IL-10水平。

6.統計學處理：臨床資料采用Excel建立數據庫，采用SPSS13.0統計軟件包進行數據分析；計量資料以±s表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，同組處理前后的比較用配對t檢驗，另行兩因素析因設計方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、AD患者外周血T細胞培養前后Rho激酶活性變化

新鮮分離的AD患者外周血T細胞Rho激酶活性（2.47%±0.89%）顯著高于健康對照組（0.65%±0.35%），差異有統計學意義（t=2.729，P＜0.05）。外周血T細胞經10%胎牛血清培養24 h后，AD患者外周血T細胞Rho激酶活性（0.70%±0.38%）較培養前顯著降低（t=2.658，P＜0.05），但與培養24 h后健康對照組（0.63%±0.32%）相比，差異無統計學意義（t=1.010，P＞0.05）。見圖1。

二、AD患者血清對T細胞Rho激酶活性的影響

T細胞與血清培養24 h后，患者T細胞+自身血清組Rho激酶活性（2.41%±0.87%）明顯高于患者T細胞+健康對照血清組（0.76%±0.41%），也顯著高于健康對照T細胞 +AD血清組（2.17%±0.85%）（P＜0.05）；健康對照T細胞+AD血清組明顯高于健康對照T細胞+自身血清組（0.64%±0.33%），差異均有統計學意義（P＜0.05）；AD患者T細胞+健康對照血清組高于健康對照T細胞+自身血清組（P＜0.05）。析因設計方差分析示，與健康對照血清培養T細胞相比，AD血清培養T細胞會增加Rho激酶活性（F=8.22，P＜0.001），AD 患者 T細胞Rho激酶活性高于健康對照T細胞（F=12.21，P＜0.001），細胞與血清存在交互作用（F=11.81，P＜ 0.001）。見圖2。

圖1 特應性皮炎（AD）患者及健康對照者外周血T細胞磷酸化MYPT-1蛋白表達 1：培養前健康對照組；2：培養前AD患者組；3：培養24 h后健康對照組；4：培養24 h后AD患者組

圖2 特應性皮炎（AD）患者血清對T細胞磷酸化MYPT-1蛋白表達的影響 1：患者T細胞+對照血清組；2：健康對照T細胞+對照血清組；3：患者T細胞+AD血清組；4：健康對照T細胞+AD血清組

三、Y27632對AD患者T細胞增殖的影響

單獨效應分析，Y27632組患者T細胞增殖率顯著低于患者T細胞組（P＜0.05），且Y27632+CD3/CD28單抗組也顯著低于CD3/CD28單抗組（P＜0.05）。CD3/CD28單抗組顯著高于患者T細胞組（P＜ 0.05），Y27632+CD3/CD28單抗組亦高于Y27632組（P＜0.05），見表1。析因設計方差分析示，Y27632可顯著抑制AD患者T細胞的增殖（F=18.68，P＜0.001），而 CD3/CD28單抗可顯著促進 AD患者T細胞的增殖（F=13.35，P＜0.001），Y27632與CD3/CD28單抗存在交互作用（F=15.39，P＜0.001）。

四、Y27632對AD患者T細胞分泌細胞因子的影響

析因設計方差分析示，Y27632可顯著抑制AD患者T細胞IL-6的分泌（F=22.95，P＜0.001），而CD3/CD28單抗可顯著促進IL-6的分泌（F=13.26，P＜0.001），Y27632與 CD3/CD28單抗存在交互作用（F=18.67，P＜0.001）。單獨效應分析，Y27632組IL-6的表達顯著低于患者T細胞組（P＜0.05），Y27632+CD3/CD28單抗組IL-6的表達顯著低于CD3/CD28單抗組（P＜0.05）。CD3/CD28單抗組IL-6的表達高于患者T細胞組（P＜0.05），Y27632+CD3/CD28單抗組IL-6的表達亦高于Y27632組（P＜0.05）。此外，CD3/CD28單抗可顯著促進IL-10的分泌（F=14.68，P＜0.001），CD3/CD28單抗組 IL-10的表達高于患者T細胞組（P＜0.05），Y27632+CD3/CD28單抗組IL-10的表達亦高于Y27632組（P＜0.05）；然而，Y27632對AD患者T細胞IL-10的分泌無明顯作用（F=1.13，P＞0.05）。見表1。

表1 Rho激酶特異性抑制劑Y27632對特應性皮炎（AD）患者T細胞增殖活性、IL-6和IL-10分泌的影響（±s）

表1 Rho激酶特異性抑制劑Y27632對特應性皮炎（AD）患者T細胞增殖活性、IL-6和IL-10分泌的影響（±s）

注：a：與患者 T 細胞組相比，P ＜ 0.05；b：與 CD3/CD28 單抗組相比，P ＜ 0.05；c：與Y27632組相比，P＜0.05

組別 例數 T細胞增殖率（%） IL-6（ng/L） IL-10（ng/L）患者T細胞組 60 102±35 389±72 112±27 Y27632組 60 51±17a 130±25a 92±23 CD3/CD28單抗組 60 228±65a 712±126a 291±56a Y27632+CD3/CD28單抗組 60 136±38bc 378±77bc 273±48c

討 論

Rho家族蛋白是小分子GTP酶，具有廣泛的生物學功能，特別在調節細胞遷移、增生、黏附、免疫反應等方面有重要作用。作為RhoA下游關鍵性信號蛋白，Rho激酶在轉導Rho信號通路活化方面起重要作用［14］，MYPT-1是 Rho激酶重要的底物，能反應 Rho 激酶的活性［15］。有研究［16］發現，RhoA/Rho 激酶信號通路活化參與調控健康人外周血單核細胞分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）等細胞因子。Segain等［17］發現，活動性克羅恩病患者炎癥部位腸黏膜RhoA和Rho激酶活性顯著高于健康對照組。本研究結果顯示，AD組外周血T細胞Rho激酶活性明顯高于對照組，同時，Rho激酶特異性抑制劑Y27632能抑制患者外周血T淋巴細胞分泌IL-6，但對IL-10的分泌沒有顯著的抑制作用。可能Rho激酶通過影響T淋巴細胞的增殖，參與AD患者的炎性因子的調控。但有關Rho激酶在AD發病機制中的具體作用及其意義仍有待進一步研究。

本研究中AD患者T細胞經體外10%胎牛血清孵育24 h后，原本增高的Rho激酶活性卻降至正常水平，同時AD患者T細胞與健康對照組血清培養后，T細胞Rho激酶活性也顯著下降，而健康對照組T細胞與AD患者血清培養后其T細胞Rho激酶活性明顯增高。上述結果提示，AD患者外周血T細胞中異常增高的Rho激酶活性可能是繼發性的，可能與其血清中存在某種“致病”因素有關。這與其他研究者發現SLE患者T細胞ERM信號通路異常活化的結果相類似［18］。動物實驗發現，IL-17能夠顯著上調變應性接觸性皮炎（ACD）皮膚模型的炎性因子表達，IL-17可通過誘導角質形成細胞增生和活化，刺激黏附分子的表達和上調下游細胞因子［19］。

T細胞的“病理性”活化通過分泌細胞因子（如IL-6）或細胞間的相互作用，參與了局部炎癥反應［20］。本研究結果顯示，Rho激酶特異性抑制劑Y27632顯著抑制AD患者T細胞增殖和分泌IL-6，提示AD患者外周血T細胞中Rho激酶可能參與其體內T細胞的內在活化。由于AD是慢性炎癥性皮膚病，病情遷延反復，推測外周血中T細胞的黏附和遷徙能力的強弱對T細胞能否遷徙并在局部浸潤起關鍵性的作用。因此，Rho激酶通路很可能是調節AD患者T細胞活化和在局部浸潤的重要靶點，通過抑制該通路活性可能有利于AD的治療。

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Changes of Rho kinase activity in peripheral blood T lymphocytes from patients with atopic dermatitis and their significance

Liang Yinghong,Wei Ming,Tu Ling,Liu Jia,Gong Yanjie,Zhang Yihua
Clinical Laboratory,Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

ObjectiveTo evaluate changes of Rho kinase（ROK）activity in peripheral blood T lymphocytes from patients with atopic dermatitis （AD）,and to analyze their clinical significance.MethodsEight milliliters of heparin-anticoagulated blood samples were collected from 60 patients with AD and 60 healthy human controls followed by separation of T lymphocytes and sera from these blood samples as well as culture of isolated T lymphocytes with 10%fetal bovine serum for 24 hours.Both patient-and control-derived T lymphocytes were classified into two groups to be cultured with patient-or control-derived sera.In addition,some patient-derived T lymphocytes were classified into 4 groups:Y27632 group treated with the Rho kinase-specific inhibitor Y2763,CD3/CD28 group treated with anti-CD3/anti-CD28 monoclonal antibodies,Y27632+CD3/CD28 group treated with Y27632 and anti-CD3/anti-CD28 monoclonal antibodies,and control group treated with patient-derived sera.Subsequently,Western-blot analysis was performed to evaluate ROK activity in cells,methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay to evaluate proliferative activity of T lymphocytes,and ELISA to measure interleukin 6 （IL-6）and IL-10 levels in supernatants of T lymphocytes.ResultsROK activity was significantly lower in fresh T lymphocytes from patients than in those from healthy controls（2.47%±0.89%vs.0.65%±0.35%,t=2.729,P＜ 0.05）.After 24-hour culture with 10%fetal bovine serumin vitro,ROK activity was significantly decreased in patient-derived T lymphocytes compared with those before culture（0.70%±0.38%vs.2.47%±0.89%,t=2.658,P＜0.05）,but no significant difference was observed between patient-and control-derived T lymphocytes（0.70% ± 0.38%vs.0.63% ±0.32%,t=1.010,P＞0.05）.Compared with T lymphocytes cultured with control-derived sera,those cultured with patient-derived sera showed significantly increased ROK activity（F=8.22,P＜0.001）.Concretely speaking,ROK activity was significantly higher in patient-derived T lymphocytes cultured with patient-derived sera than in those cultured with control-derived sera（2.41%±0.87%vs.0.76% ±0.41%,P＜0.05）,and higher in control-derived T lymphocytes cultured with patient-derived sera than in those cultured with control-derived sera（2.17% ±0.85%vs.0.64%±0.33%,P＜0.05）at 24 hours.Y27632 could significantly inhibit the proliferation of as well as secretion of IL-6（F=18.68,22.95,respectively,bothP＜ 0.001）by patient-derived T lymphocytes,but had insignificant effects on secretion of IL-10.The cellular proliferative activity and IL-6 supernatant level were significantly lower in the Y27632 group than in the control group,and lower in the Y27632+CD3/CD28 group than in the CD3/CD28 group （allP＜0.05）.ConclusionAberrant activation of ROK exists in T lymphocytes from patients with AD,which may play a certain role in the pathogenesis of AD.

Dermatitis,atopic;T-lymphocytes;rho-Associated kinases;Signal transduction;Interleukin-6;Interleukin-10

Wei Ming,Email:gushiweiming@126.com

魏明，Email：gushiweiming@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.04.007

2015-05-18）

（本文編輯：周良佳 顏艷）