磷酸化c-Jun氨基末端激酶和P38絲裂原活化蛋白激酶在尋常性銀屑病皮損中的表達

葛新紅 唐真真 焦亞寧 吳昊 喻楠 董靈娣 李樂 楊彪 蒲小霞

750004銀川，寧夏醫科大學總醫院皮膚科（葛新紅、焦亞寧、喻楠、董靈娣、李樂）；山東省蘭陵縣人民醫院皮膚科（唐真真）；寧夏醫科大學（吳昊、楊彪、蒲小霞）

磷酸化c-Jun氨基末端激酶和P38絲裂原活化蛋白激酶在尋常性銀屑病皮損中的表達

葛新紅 唐真真 焦亞寧 吳昊 喻楠 董靈娣 李樂 楊彪 蒲小霞

750004銀川，寧夏醫科大學總醫院皮膚科（葛新紅、焦亞寧、喻楠、董靈娣、李樂）；山東省蘭陵縣人民醫院皮膚科（唐真真）；寧夏醫科大學（吳昊、楊彪、蒲小霞）

目的 探討磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）和P38絲裂原活化蛋白激酶（p-P38MAPK）在尋常性銀屑病皮損中的表達。方法 收集30例確診的尋常性銀屑病患者皮損，同時收集30例健康人皮膚組織作為對照組。采用免疫組化及Western印跡法分別檢測p-JNK和p-P38MAPK蛋白在尋常性銀屑病皮損組織和正常人皮膚中的表達情況。結果 免疫組化結果顯示，尋常性銀屑病皮損組織p-JNK和p-P38MAPK表達的平均吸光度（AOD）值分別為0.663±0.016和0.436±0.011，均明顯高于對照組（0.333±0.009和0.306±0.010），差異有統計學意義（t=44.869、21.913，均P＜0.001）。Western印跡法同樣顯示，尋常性銀屑病皮損p-JNK和p-P38MAPK蛋白相對表達量均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（t值分別為20.477和165.084，均P＜0.05）。結論 JNK和P38MAPK的活化可能參與了尋常性銀屑病表皮細胞的過度增殖。

銀屑病；JNK絲裂原活化蛋白激酶類；p38絲裂原活化蛋白激酶類；c-Jun氨基末端激酶

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK 有3個主要家族成員——細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2），c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）及P38絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK），該通路被激活后經過細胞質中銜接蛋白、酶的級聯反應，調節轉錄因子，激活基因的轉錄，指導細胞增殖、分化、凋亡等。銀屑病是一種以表皮過度增殖為主要特征的慢性炎癥性皮膚病，研究發現，磷酸化ERK1/2及其上游激活因子表皮生長因子受體（EGFR）和下游轉錄因子Elk-1在尋常性銀屑病皮損中的表達增強［1］，但JNK2和P38MAPK在尋常性銀屑病發病中的激活狀態尚不清楚。本文旨在從蛋白水平研究MAPK中磷酸化 JNK（p-JNK）、P38MAPK（p-P38MAPK）在尋常性銀屑病中的表達，以探討JNK和P38MAPK在尋常性銀屑病發生中的作用。

對象與方法

一、對象

2013年8月至2014年9月就診于寧夏醫科大學總醫院皮膚科、經臨床和病理確診的尋常性銀屑病患者30例，其中男18例，女12例，年齡13～62（29.8±4.15）歲，病程2個月至11年。納入標準：銀屑病面積和嚴重程度指數（PASI）≥10及皮損面積＞10%的中、重度穩定期尋常性銀屑病患者；取皮膚標本前1個月內未服用過糖皮質激素、免疫抑制劑、維A酸類藥物及其他系統治療藥物，1個月內未外用治療銀屑病的藥物；不伴有其他類型皮膚病、腫瘤或其他嚴重疾患。同時收集本院皮膚整形外科手術的30份正常皮膚組織作為對照組，男16例，女14例，年齡15～59（27.9±3.32）歲?；颊呓M和對照組在性別、年齡分布上差異無統計學意義（P＞0.05），且取材部位上相匹配。尋常性銀屑病標本取自軀干典型皮損，沿皮紋走向行梭形切口（1cm×0.5cm）。所有組織標本均分為兩部分，一部分用液氮速凍，-80℃冰箱保存，用于Western印跡法檢測；另一部分用4%甲醛固定，常規石蠟包埋，用于免疫組化染色。本研究經過寧夏醫科大學總醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

二、主要試劑

＃4668兔抗人單克隆抗體 p-JNK（Thr183/Tyr185位點）、＃4511p-P38MAPK（Thr180/Tyr182位點）（美國Cell Signaling Technology公司），DAB顯色試劑盒、PV-6001試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），NC膜（德國Schleicher&Schuell公司），內參GAPDH（杭州賢至生物科技有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）。

三、實驗方法

1.免疫組化染色：常規二步法，4 μm厚切片，常規脫蠟，修復，3%H2O2孵育10 min，分別加入稀釋的一抗：p-JNK（1 ∶50）、p-P38MAPK（1 ∶1 600），4 ℃過夜，滴加二抗室溫孵育1 h，DAB顯色、復染、封片。選擇乳腺癌標本作陽性對照，PBS作為陰性對照。利用圖像采集系統400倍下連續拍照，Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統，每張切片隨機選取10個高倍視野（×400），測定陽性區域圖像的積分吸光度（IOD）值。平均吸光度（AOD）值=IOD值/面積。

2.Western印跡法：提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，經10%SDS丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移至NC膜上。將NC膜浸入5%BSA封閉液，于室溫置搖床平緩搖動1 h；加一抗4℃孵育過夜，二抗室溫置搖床平緩搖動1 h，中間均用TBST漂洗5 min×5次。化學發光，曝光，顯影，定影；凝膠成像系統拍照，經Gel-Pro analyzer分析系統對目的顯色條帶進行吸光度（A值）分析和掃描，觀察各實驗組泳道膜上棕黑色目的蛋白帶密度灰度，以內參GAPDH作為參照。

四、統計學方法

結 果

一、免疫組化檢測尋常性銀屑病皮損和對照組皮膚p-JNK和p-P38MAPK的表達

p-JNK在對照組皮膚表皮的個別細胞核中有少量淡黃色表達，而在尋常性銀屑病皮損表皮全層細胞的細胞核和細胞質中呈深棕色表達，在個別淋巴細胞胞核上也有表達。見圖1。尋常性銀屑病皮損組織p-JNK的相對表達量明顯高于對照組，兩組差異有統計學意義。見表1。

p-P38MAPK的表達主要定位于細胞核，在正常對照皮膚表皮細胞核中有少量表達，呈淺棕色，而在尋常性銀屑病皮損表皮全層細胞的細胞核中有大量表達，呈深棕色。見圖1。尋常性銀屑病皮損組織p-P38MAPK的相對表達量明顯高于對照組，兩組差異有統計學意義。見表1。

二、Western印跡法檢測尋常性銀屑病皮損和正常對照皮膚p-JNK和p-P38MAPK的表達

尋常性銀屑病皮損與正常對照皮膚均有p-JNK和p-P38MAPK的表達，且尋常性銀屑病皮損p-JNK和p-P38MAPK蛋白相對表達量均顯著高于對照組，差異均有統計學意義。見表1、圖2。

圖1 p-JNK和p-P38MAPK在正常皮膚組織和尋常性銀屑病皮損組織的表達（免疫組化×400） p-JNK在正常對照皮膚個別表皮細胞核中有少量表達，呈淡褐色，在尋常性銀屑病皮損表皮全層細胞的細胞核和細胞質中呈深棕色表達；p-P38MAPK在正常對照皮膚表皮細胞核中有少量表達，呈淺棕色，在尋常性銀屑病皮損表皮全層細胞的細胞核中有表達，呈深棕色

表1 尋常性銀屑病患者皮損和正常對照組皮膚p-JNK和p-P38MAPK的表達水平比較（±s）

表1 尋常性銀屑病患者皮損和正常對照組皮膚p-JNK和p-P38MAPK的表達水平比較（±s）

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圖2 Western印跡法檢測尋常性銀屑病皮損與正常對照皮膚中p-JNK和p-P38MAPK蛋白的相對表達量 1：正常對照皮膚；2：尋常性銀屑病皮損；尋常性銀屑病皮損中p-JNK和p-P38MAPK蛋白的表達均明顯高于正常對照皮膚

討 論

正常細胞依靠細胞內各種信號傳導分子的活化來完成其增殖、分化、凋亡的生命歷程。若機體內細胞信號轉導功能異常改變，會導致細胞增殖和分化異常等。銀屑病作為一種慢性炎癥性皮膚病，與表皮細胞過度增殖及異常分化、真皮乳頭血管增生等有關。MAPK主要參與了細胞的增殖與分化，有關尋常性銀屑病與信號通路的研究成為近年生物醫學研究領域的熱點。

MAPK是能夠接受各種有絲分裂原刺激而活化的一種蛋白激酶，在細胞增殖調控中發揮極其重要的作用。MAPK的激活在腫瘤的發生中起著重要的作用，我們的前期研究［2］發現，磷酸化的MAPK家族的 3個主要成員（ERK1/2、JNK和P38MAPK）與其上游因子EGFR及下游轉錄因子Elk-1在日光性角化病（AK）和皮膚鱗狀細胞癌（SCC）中的表達較正常皮膚明顯增強，且 p-EGFR、p-ERK1/2、p-JNK、p-P38MAPK及p-Elk-1蛋白在皮膚SCC中的表達與其病理分級有關，推測磷酸化的 EGFR→ERK1/2、JNK、P38MAPK→Elk-1信號轉導途徑可能在AK和SCC的發生發展中起重要的促進作用。

MAPK的激活在尋常性銀屑病發病中的作用尚不清楚。張曉艷等［3］研究發現，與正常人表皮中MAPK的激酶活性相比，銀屑病患者皮損區MAPK的活性明顯增高，而非皮損區無明顯改變，認為MAPK可能參與了銀屑病表皮細胞過度增殖的調節。我們的前期研究［1］還發現，磷酸化的 ERK1/2、EGFR 和Elk-1在尋常性銀屑病皮損中的表達較正常皮膚的表達明顯增強，推測p-EGFR→ERK1/2→Elk-1這條信號通路的傳導增強可能在尋常性銀屑病的病理生理過程中起重要的作用。但JNK與P38MAPK與尋常性銀屑病的關系尚存爭議。Chen等［4］發現JNK-c-Jun的激活可以促進尋常性銀屑病FOXP3的核轉錄。Arasa等［5］發現，抑制SAPK/JNK通路可影響尋常性銀屑病細胞因子的釋放和STAT3通路的激活。Takahashi等［6］研究表明，磷酸化的JNK在尋常性銀屑病受累皮膚較非受累皮膚表達升高，但磷酸化P38MAPK在尋常性銀屑病皮損與正常人皮膚中的表達無差異，且磷酸化JNK在銀屑病患者未受累皮膚和正常人皮膚只表達于顆粒層，在銀屑病皮損的顆粒層和棘層均有表達。本研究顯示，磷酸化的JNK在正常對照皮膚的個別細胞核中有較弱的表達，在尋常性銀屑病皮損表皮全層細胞的細胞核和細胞質中呈深棕色表達，其表達程度明顯高于正常對照組，而磷酸化的P38MAPK在尋常性銀屑病皮損和正常對照組皮膚中均表達于細胞核中，但在銀屑病皮損中的表達明顯增強。在MAPK家族中JNK與P38定位于細胞質與（或）細胞核，以非活化形式存在。一旦被激活，細胞質中的JNK與P38移位到細胞核。JNK與P38MAPK可以誘導Th1/Th2分化，與銀屑病表皮高度增殖有關，前者主要誘導Th2分化，后者主要誘導Th1分化［7］。同時JNK激活后也可通過程序性細胞死亡而終止病毒復制，表明JNK可能是宿主細胞通過細胞凋亡的作用抵抗病毒入侵的一個防御機制，這可阻斷由感染誘發的銀屑病。

［1］葛新紅,秦璟,張曉鳴,等.細胞外信號調節激酶在尋常性銀屑病皮損中的表達［J］.中華皮膚科雜志,2010,43（12）:855-858.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2010.12.011.Ge XH,Qin J,Zhang XM,et al.Expression of extracellular signalregulated kinase in lesions of psoriasis vulgaris［J］.Chin J Dermatol,2010,43（12）:855-858.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2010.12.011.

［2］葛新紅,唐真真,焦亞寧,等.光線性角化病和鱗狀細胞癌表皮生長因子受體與MAPK信號通路的研究［J］.中華皮膚科雜志,2015,48（7）:451-454.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.07.003.Ge XH,Tang ZZ,Jiao YN,et al.Epidermal growth factor receptor and MAPK signaling pathways in actinic keratosis and cutaneous squamous cell carcinoma［J］.Chin J Dermatol,2015,48（7）:451-454.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.07.003.

［3］張曉艷,張立新,馬圣清,等.銀屑病患者皮損中有絲分裂原激活的蛋白激酶的活性研究［J］.皮膚病與性病,2005,27（1）:4-6.DOI:10.3969/j.issn.1002-1310.2005.01.002.Zhang XY,Zhang LX,Ma SQ,et al.Up-regulation of mitogenactivated protein kinase activity in psoriatic lesions［J］.J Dermatol Venereol,2005,27（1）:4-6.DOI:10.3969/j.issn.1002-1310.2005.01.002.

［4］Chen L,Wu J,Ren W,et al.c-Jun N-terminal kinase（JNK）-phospho-c-JUN （ser63/73）pathway is essential for FOXP3 nuclear translocation in psoriasis［J］.J Dermatol Sci,2013,69（2）:114-121.DOI:10.1016/j.jdermsci.2012.10.018.

［5］Arasa J,Terencio MC,Andrés RM,et al.Decreased SAPK/JNK signalling affects cytokine release and STAT3 activation in psoriatic fibroblasts［J］.Exp Dermatol,2015,24 （10）:800-802.DOI:10.1111/exd.12787.

［6］Takahashi H,Ibe M,Nakamura S,et al.Extracellular regulated kinase and c-Jun N-terminal kinase are activated in psoriatic involved epidermis［J］.J Dermatol Sci,2002,30（2）:94-99.DOI:10.1016/S0923-1811（02）00064-6.

［7］Rengarajan J,Szabo SJ,Glimcher LH.Transcriptional regulation of Th1/Th2 polarization［J］.Immunol Today,2000,21（10）:479-483.DOI:10.1016/S0167-5699（00）01712-6.

Expressions of phosphorylated c-Jun N-terminal kinase and P38 mitogen-activated protein kinase in psoriasis vulgaris lesions

Ge Xinhong,Tang Zhenzhen,Jiao Yaning,Wu Hao,Yu Nan,Dong Lingdi,Li Le,Yang Biao,Pu Xiaoxia Department of Dermatology,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China（Ge XH,Jiao YN,Yu N,Dong LD,Li L）;Department of Dermatology,Lanling People′s Hospital,Linyi 277700,Shandong,China（Tang ZZ）;Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China（Wu H,Yang B,Pu XX）

ObjectiveTo investigate expressions of phosphorylated c-Jun N-terminal kinase（p-JNK）and P38 mitogen-activated protein kinase（p-P38MAPK）in psoriasis vulgaris lesions.MethodsTissue specimens were obtained from lesions of 30 patients with psoriasis vulgaris and normal skin of 30 healthy human controls.An immunohistochemical study and Western-blot analysis were performed to measure protein expressions of p-JNK and p-P38MAPK in these skin specimens.ResultsAs the immunohistochemical study showed,the expressions of p-JNK and p-P38MAPK（expressed as the average optical density ［AOD］value for targeted proteins）were significantly higher in psoriasis vulgaris lesions than in normal skin tissues（p-JNK:0.663±0.016 vs.0.333±0.009,t=44.869,P＜0.001;p-P38MAPK:0.436±0.011 vs.0.306±0.010,t=21.913,P＜0.001）.Western-blot analysis also showed increased protein expressions of p-JNK and p-P38MAPK in psoriasis vulgaris lesions compared with normal skin tissues（t=20.477,165.084,respectively,bothP＜0.05）.ConclusionThe activation of JNK and P38MAPK may be involved in the overproliferation of epidermal cells in psoriasis vulgaris lesions.

Psoriasis;JNK mitogen-activated protein kinases;p38 mitogen-activated protein kinases;C-Jun N-terminal kinase

Ge Xinhong,Email:gexinhong.0101@163.com

葛新紅，Email：gexinhong.0101@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.04.005

國家自然科學基金（81060181）；寧夏自然科學基金（NZ14121）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81060181）;Natural Science Foundation of Ningxia Hui Autonomous Region of China（NZ14121）

2015-08-13）

（本文編輯：周良佳 顏艷）