miRNA-146a對尋常性銀屑病患者外周血CD4+T細胞的調控研究

魏明 梁穎紅 涂玲 劉佳 龔艷杰 張宜花 楊璐

450052鄭州大學第五附屬醫院檢驗科

miRNA-146a對尋常性銀屑病患者外周血CD4+T細胞的調控研究

魏明 梁穎紅 涂玲 劉佳 龔艷杰 張宜花 楊璐

450052鄭州大學第五附屬醫院檢驗科

目的 研究miRNA-146a對尋常性銀屑病患者外周血CD4+T淋巴細胞的調控，探討miRNA-146a在尋常性銀屑病發病中的作用。方法 收集尋常性銀屑病患者和健康對照各30例。采用實時定量PCR檢測外周血CD4+T淋巴細胞miRNA-146a表達水平，ELISA檢測血漿干擾素（IFN）-γ、白細胞介素（IL）-4表達水平。免疫磁珠法分選外周血CD4+T淋巴細胞，將分離的細胞分為對照組、miRNA-146a組和miRNA-146a抑制物組，分別轉染陰性對照miRNA、miRNA-146a模擬物和miRNA-146a抑制物后進行細胞培養，流式細胞儀檢測Th1和Th2細胞數量，蛋白免疫印跡法和實時定量PCR分別檢測IFN-γ受體α（IFN-γRα）、T細胞表達T盒（T-bet）、GATA-3蛋白和mRNA的表達，ELISA檢測細胞培養液上清液IFN-γ、IL-4水平。結果 尋常性銀屑病患者外周血CD4+T淋巴細胞miRNA-146a［（243.81±94.32）%］與血漿IFN-γ水平［（27.69±7.64）ng/L］較健康對照組［分別為（105.74±22.93）%和（9.75±2.81）ng/L］升高，差異均有統計學意義（t值分別為 6.653和 4.237，均P＜0.01），且miRNA-146a的表達與血清IFN-γ呈正相關（r=0.837，P＜0.01）。體外CD4+T淋巴細胞培養結果顯示，與對照組比較，miRNA-146a組Th1數量、T-bet蛋白和mRNA表達、培養上清液IFN-γ水平均顯著增加，IFN-γRα蛋白表達降低，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；但是，與對照組比較，miRNA-146a組和miRNA-146a抑制物組Th2細胞數量、GATA-3蛋白、GATA-3 mRNA表達以及上清液中IL-4水平差異無統計學意義（均P＞0.05）。結論 miRNA-146a可能通過影響Th1細胞的分化和功能參與對尋常性銀屑病患者外周血CD4+T淋巴細胞的調控，在銀屑病發病過程中發揮一定的作用。

銀屑病；RNA；T淋巴細胞，輔助誘導；干擾素γ；白細胞介素4；微RNAs

銀屑病是一種多基因遺傳背景下由T淋巴細胞介導的慢性炎癥性皮膚病，CD4+T細胞及多種細胞因子在銀屑病的發病中起重要作用［1］。微小RNA（micro-RNA，miRNA）是一類高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，參與調控細胞生長、發育、分化和增殖等多個生命過程［2］，參與免疫細胞分化和成熟、抗體產生、炎性因子釋放等免疫過程，對機體免疫功能的正常發揮起非常重要的作用［3］。研究表明，miRNA-146a可影響CD4+T淋巴細胞亞群分化、增殖和活化的過程［4-5］，但miRNA-146a在尋常性銀屑病中的表達對CD4+T細胞是否有作用尚不清楚。我們通過研究miRNA-146a對尋常性銀屑病患者外周血CD4+T淋巴細胞亞群的調控，探討miRNA-146a在銀屑病發病中的作用。

材料與方法

1.研究對象：2011年10月7日至2014年12月25日就診于鄭州大學第五附屬醫院皮膚性病科門診的尋常性銀屑病患者30例，采用銀屑病面積和嚴重程度指數（psoriasis area and severity index，PASI）［6］對病情進行評分，其中男 18 例，女 12 例，平均年齡18.60歲，病程1個月至30年，平均7.1年，PASI評分1.8～50.0分，平均14.36分。患者近4周內未接受糖皮質激素或免疫抑制劑等系統治療，未合并其他皮膚病及自身免疫性疾病、心血管疾病、神經系統疾病、內分泌系統疾病、呼吸系統疾病、肝病或腫瘤等。健康對照組30例，其中男11例，女9例，平均年齡18.46歲。兩組性別構成、年齡差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究獲醫院倫理委員會批準，所有病例選擇和標本提取均獲患者知情同意并簽署同意書。

2.標本采集：取肝素抗凝外周靜脈血10 ml用于ELISA檢測和CD4+T淋巴細胞分離；取其中9例患者外周血分離的CD4+T淋巴細胞用于體外培養干預實驗。本試驗遵照鄭州大學醫學倫理委員會人體試驗管理規范執行。

3.主要試劑與儀器：改良型RPMI 1640培養基（美國Hyclone公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），人淋巴細胞分離液（北京索萊寶科技有限公司），Trizol試劑（北京天根生化科技有限公司），藻紅蛋白（P-phycoerythrin）-青色素（cyanine）染料 5（PE-Cy5）標記小鼠抗人 CD4 單克隆抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）標記小鼠抗人IFN-γ單克隆抗體、藻紅蛋白（PE）標記小鼠抗人IL-4單克隆抗體（美國Biolegend公司），佛波酯、離子霉素、莫能星（monensin）（美國 Sigma公司），破膜劑（美國BD公司），人CD4+T細胞分選試劑盒（挪威Dynal公司），干擾素（IFN）-γ受體 α（IFN-γRα）、T細胞表達 T 盒（T-box expressed in T cells，T-bet）、GATA 結合蛋白 3（GATA-binding protein 3，GATA-3）、β 肌動蛋白多克隆抗體（美國Proteintech Group公司），人IFN-γ、IL-4 ELISA定量檢測試劑盒（美國R&D公司），實時定量PCR試劑盒（美國GeneCopeia公司），Epics XL型流式細胞儀（美國Beckman-Coulter公司），垂直電泳儀、電泳槽、蛋白電泳轉膜裝置、GelDoc 2000型凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad公司）。

4.細胞分離、培養及體外轉染：采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個核細胞。免疫磁珠法進一步從單個核細胞中分離CD4+T淋巴細胞，流式細胞儀檢測細胞的純度，0.2%臺盼藍鑒定活細胞數。將分離獲取的細胞調整為2×106/ml，并分為對照組（轉染50 nmol/L陰性對照miRNA）、miRNA-146a組（轉染50 nmol/L miRNA-146a模擬物）和miRNA-146a抑制物組（轉染50 nmol/L miRNA-146a 抑制物）。陰性對照 miRNA、5′-miRNA-146a模擬物與miRNA-146a抑制物的序列分別為 5′-CGCGAGAAGAUGACCCAGAU-3′、5′-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGUCCCUAUCACG AUUAGCAUUAAUU-3′和 5′-ACCCCUAUCACGAU UAGCAUUAA-3′。用脂質體2000進行轉染，轉染過程嚴格按操作說明進行。轉染5 h后，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，取少量細胞懸液涂布于載玻片上，倒置相差熒光顯微鏡下觀察，轉染成功的細胞發出綠光。計算轉染率，轉染率=發出綠色熒光的細胞數/可見光下總細胞數×100%，48 h后，細胞計數，收集細胞。

5.流式細胞儀檢測Th1和Th2細胞：取2.0×105/ml CD4+T淋巴細胞，加含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基，加入佛波酯（25 μg/L）、離子霉素（1 mg/L）、莫能星（1.7 mg/L），孵育 5 h，離心后加破膜劑500 μl，破膜 10 min后分別加 PE-CY5-CD4，PE-IL-4和FITC-IFN-γ單抗，對照管加同型對照抗體，室溫下孵育15 min，上機行流式細胞儀檢測。

6.ELISA檢測IFN-γ、IL-4水平：將全血以850×g離心15 min后取血漿，放置在-80℃冰箱中備用，集中檢測。取2×106/ml轉染后的CD4+T淋巴細胞和對照組CD4+T淋巴細胞分別加入5 μg/L的植物凝血素，于37℃、5%CO2培養箱中培養刺激48 h后收集上清液。采用ELISA法檢測血漿和上清液IFN-γ、IL-4的表達水平，操作按說明書進行。

7.蛋白免疫印跡法檢測 T-bet、GATA-3、IFN-γRα蛋白的表達：在植物凝血素刺激后收集細胞，用蛋白裂解液提取細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。取蛋白樣品于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉至聚偏氟乙烯膜上。室溫下封閉1 h，加入兔抗人T-bet多克隆抗體（1∶500），兔抗人GATA-3多克隆抗體（1∶500），兔抗人IFN-γRα 多克隆抗體（1∶500）室溫孵育 2 h，以小鼠抗人β肌動蛋白單克隆抗體（1∶2 000）作為內參。漂洗后加相應二抗孵育1 h，加入ECL發光劑，曝光，顯影并定影。用Quantity One軟件分析目標條帶的灰度值，以目標條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

8.實時定量 PCR 檢測 miRNA-146a、T-bet、GATA-3和IFN-γRα mRNA的表達：體外培養細胞在植物凝血素刺激后，用Trizol提取總RNA，反轉錄合成cDNA，建立PCR反應體系。miRNA-146a及內參照U6引物由美國GeneCopeia公司提供（miRNA-146a擴增應用miScript通用引物及其特異性引物，分別為：5′-UGAGAACU GAAUUCCAUGGGUU-3′和 U6：5′-CTCGCTTCGGCAG CAGC ACA-3′）。 T-bet、GATA-3、IFN-γRα及β肌動蛋白引物［生工生物工程（上海）有限公司合成］見表1。PCR反應步驟如下：95℃變性10min；40個循環（95 ℃，10 s；退火，20 s；72 ℃，31 s）。miRNA-146a的 PCR反應退火溫度為 60℃，T-bet、GATA-3、IFN-γRα的PCR反應退火溫度均為58℃。擴增反應結束后，從72℃緩慢加熱到95℃，以建立PCR產物的熔解曲線。每個標本均設置2個復管行PCR反應。根據各基因實時擴增曲線和熔解曲線，取Ct值，按 2-△△Ct法計算待測目的基因相對表達量，2-△△Ct值相差3倍認為表達有差異［7］。

9.統計學方法：應用SPSS 13.0統計軟件對數據進行統計學分析。計量數據以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析并進行多重比較，相關性采用直線相關分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1.外周血CD4+T淋巴細胞miRNA-146a的表達：尋常性銀屑病患者組miRNA-146a的表達（243.81%±94.32%）高于健康對照組（105.74%±22.93%），兩組差異有統計學意義（t=6.653，P＜0.01）。

2.血漿IFN-γ、IL-4水平：尋常性銀屑病組患者血漿 IFN-γ水平［（27.69±7.64）ng/L］顯著高于健康對照組［（9.75± 2.81）ng/L］，兩組差異有統計學意義（t=4.237，P＜0.01）；兩組 IL-4水平分別為（12.65±2.17）ng/L和（11.38±2.23）ng/L，差異無統計學意義（t=0.037，P＞0.05）。患者組外周血CD4+T淋巴細胞miRNA-146a表達與IFN-γ水平呈正相關（r=0.837，P＜0.01），與 IL-4水平無相關關系（r=0.004，P＞ 0.05）。

表1 引物序列

表2 體外培養銀屑病患者外周血單個核細胞中干擾素γ（INF-γ）+CD4+T細胞和白細胞介素4（IL-4）+CD4+T細胞比例以及培養上清液INF-γ、IL-4水平（±s）

表2 體外培養銀屑病患者外周血單個核細胞中干擾素γ（INF-γ）+CD4+T細胞和白細胞介素4（IL-4）+CD4+T細胞比例以及培養上清液INF-γ、IL-4水平（±s）

注：a：與對照組比較，P ＜ 0.01；b：與 miRNA-146a組比較，P ＜ 0.01

處理組例數IFN-γ+（%)IL-4+（%)IFN-γ（ng/L)IL-4（ng/L)對照組 9 19.28±2.41 2.08±0.32 32.33±4.22 9.11±1.15 miRNA-146a組 9 33.12±2.87a 2.16±0.30 54.69±6.26a 8.59±1.13 miRNA-146a抑制物組 9 24.45±3.31b 2.11±0.31 43.14±5.73b 8.87±1.14 F值 55.367 0.481 45.638 0.376 P值 ＜0.01 0.612 ＜0.01 0.679

3.體外CD4+T淋巴細胞培養后Th1和Th2細胞變化：miRNA-146a組Th1細胞比例顯著高于對照組和miRNA-146a抑制物組（均P＜0.01）。3組間Th2細胞比例差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

4.體外細胞培養上清液IFN-γ、IL-4水平：miRNA-146a組IFN-γ水平顯著高于對照組和miRNA-146a抑制物組（均P＜0.01）。3組間IL-4水平差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

5.IFN-γRα、T-bet、GATA-3 蛋白表達 ：miRNA-146a組IFN-γRα蛋白表達顯著低于對照組和miRNA-146a抑制物組，T-bet蛋白表達顯著高于后兩組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。3組間GATA-3蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。患者組IFN-γRα蛋白表達與IFN-γ水平呈顯著負相關（r=-0.753，P＜0.01），與IL-4表達無明顯相關性（r=0.038，P＞0.05）。見表3，圖1。

表3 體外培養銀屑病患者外周血單個核細胞中CD4+T細胞中干擾素γ受體α（IFN-γRα）、T-bet、GATA3蛋白及 mRNA 表達（±s）

表3 體外培養銀屑病患者外周血單個核細胞中CD4+T細胞中干擾素γ受體α（IFN-γRα）、T-bet、GATA3蛋白及 mRNA 表達（±s）

注：IFN-γRα：IFN-γ 受體 α；T-bet：T 細胞表達 T 盒；GATA-3:鳥嘌呤腺嘌呤胸腺嘧啶腺嘌呤序列結合蛋白-3。a：與對照組比較，P ＜ 0.01；b：與miRNA-146a組比較，P＜0.01

處理組 例數對照組 9 0.95±0.09 0.75±0.06 0.57±0.06 1.01±0.16 1.04±0.15 1.03±0.31 miRNA-146a組 9 0.41±0.06a 0.76±0.07 1.21±0.11a 1.12±0.17 1.14±0.16 2.26±0.68a miRNA-146a抑制物組 9 0.62±0.06b 0.77±0.07 0.89±0.07b 1.08±0.16 1.12±0.15 1.69±0.67b F值 143.217 0.086 152.353 1.024 1.536 12.753 P值 ＜0.01 0.901 ＜0.01 0.351 0.231 ＜0.01 IFN-γRα蛋白 GATA3蛋白 T-bet蛋白 IFN-γRα mRNA GATA3 mRNA T-bet mRNA

圖1 銀屑病患者外周血CD4+T淋巴細胞干擾素γ受體α（IFN-γRα）、T-bet、GATA-3 蛋白的表達 1：對照組；2：miRNA-146a組；3：miRNA-146a抑制物組

6. 體外培養細胞IFN-γRα、T-bet，GATA3mRNA表達變化：miRNA-146a組 T-bet mRNA表達水平顯著高于對照組和miRNA-146a抑制物組 （均P＜ 0.01）；3 組間 IFN-γRα、GATA-3 mRNA表達差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

討 論

miRNA存在于基因組的非編碼區，通過靶mRNA靶位點與3′端非翻譯區的堿基配對，參與轉錄后調控，調節細胞增殖、分化、凋亡的生物學過程［8-9］。Zibert等［10］發現，丹麥尋常性銀屑病患者皮損和未受累健康皮膚組織中miRNAs的表達具有差異性。Sonkoly等［11］采用實時定量PCR方法對銀屑病患者和健康人體不同組織中miRNA-146a等表達譜進行分析比較，結果顯示，miRNA-146a在銀屑病皮損中表達量較健康人皮膚明顯增加。Koga等［12］研究結果顯示，銀屑病患者外周血單個核細胞中miRNA-146a量也升高，上調的miRNA-146a可能通過對T細胞的調節作用抑制過度的慢性炎癥反應。miRNA-146a作為一個負調控分子，可通過互補結合于白細胞介素-1受體相關激酶1（IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）的3′端非翻譯區，在轉錄后水平抑制TRAF6和IRAK1的表達［13-14］，從而對天然免疫應答中細胞內信號轉導起一種負反饋調節作用［15］，提示尋常性銀屑病患者miRNA-146a表達升高可能損傷了機體的天然免疫，在尋常性銀屑病的發病過程中發揮一定的作用。

越來越多的研究表明，miRNA參與了CD4+T淋巴細胞活化的過程，抗CD3抗體刺激活化的T淋巴細胞可導致多種 miRNA 表達的改變［16］。Guo 等［17］研究表明，miRNA-146a可導致Th1/Th2亞群失衡從而參與急性冠脈綜合征的發病過程。本研究結果顯示，miRNA-146a在尋常性銀屑病患者的CD4+T淋巴細胞表達明顯上調，且和細胞因子IFN-γ表達水平呈正相關，提示miR-146a參與尋常性銀屑病患者CD4+T淋巴細胞的調控，可能影響Th1細胞的分化和功能。進一步體外細胞培養結果顯示，miRNA-146a干預可以明顯增加Th1細胞主要轉錄因子T-bet蛋白和mRNA表達，主要的細胞因子IFN-γ表達也明顯增加。提示miRNA-146a可能通過復雜的調控網絡對細胞信號轉導通路進行調控，影響T-bet及效應因子IFN-γ的表達。而IFN-γRα的mRNA表達無明顯改變，蛋白表達降低。表明IFN-γRα可能是miRNA-146a的直接靶基因，通過IFN-γRα介導的IFN-γ刺激信號在Th1細胞的分化過程中起重要作用。推測miRNA-146a促進Th1細胞分化的作用可能與下調IFN-γRα的蛋白表達有關。

但在本研究中，尋常性銀屑病患者體外培養CD4+T淋巴細胞給予miRNA-146a干預后，Th2細胞數量及活化均無明顯改變。其原因可能與疾病過程中細胞的狀態及誘導分化的條件有關，且miRNA對基因調控途徑是一個復雜的網絡，其可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過多個miRNA的共同作用來精細調控某個基因的表達［18］。因此，可能有多個miRNA共同參與尋常性銀屑病患者CD4+T淋巴細胞分化及活化相關靶基因的調控，最終的調控效應表現為對Th2的分化和功能無明顯影響，但miRNA對Th2作用有待進一步探討。

綜上所述，尋常性銀屑病患者外周血CD4+T淋巴細胞miRNA-146a的表達增加，可通過調控CD4+T淋巴細胞使其偏向Th1細胞分化，導致Th1/Th2的失衡，同時可活化和增強Th1的功能，主要炎癥細胞因子分泌增加，繼而導致尋常性銀屑病免疫調控功能紊亂。因此，CD4+T淋巴細胞miRNA-146a的表達增加在尋常性銀屑病的發生過程中具有重要的作用，但miRNA-146a在尋常性銀屑病中的具體作用機制尚待進一步研究。

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Regulatory effects of miRNA-146a on peripheral blood CD4+T lymphocytes from patients with psoriasis vulgaris

Wei Ming,Liang Yinghong,Tu Ling,Liu Jia,Gong Yanjie,Zhang Yihua,Yang Lu
Clinical Laboratory,Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

ObjectiveTo evaluate regulatory effects of miRNA-146a on peripheral blood CD4+T lymphocytes from patients with psoriasis vulgaris,and to investigate the role of miRNA-146a in the pathogenesis of psoriasis vulgaris.MethodsTotally,30 patients with psoriasis vulgaris and 30 healthy human controls were enrolled into this study.Venous blood samples were obtained from these subjects,and CD4+T lymphocytes were isolated from these samples by using magnetic activated cell sorting （MACS）.Real-time quantitative PCR （RT-PCR）was performed to measure the expression of miRNA-146a in peripheral blood CD4+T lymphocytes,and enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）to determine plasma levels of interferon-γ（IFN-γ）and interleukin 4（IL-4）.Some CD4+T lymphocytes were divided into 3 groups to be transfected with 50 nmol/L negative control miRNA （control group）,miRNA-146a mimics（miRNA-146a group）or miRNA-146a inhibitor （miRNA-146a inhibitor group）.After 24-hour additional culture,flow cytometry was conducted to determine the number of Th1 and Th2 cells,Western-blot analysis and RT-PCR were performed to measure the protein and mRNA expressions of IFN-γ receptor α （IFN-γRα）,T-box expressed in T cells （T-bet）and GATA-binding protein-3 （GATA-3）respectively,and ELISA was carried out to determine the levels of IFN-γ and IL-4 in supernatants of CD4+T lymphocytes.ResultsCompared with the healthy control group,the patient group showed significantly increased miRNA-146a expression in peripheral blood CD4+T lymphocytes（243.81% ±94.32%vs.105.74%±22.93%,t=6.653,P＜0.01）and plasma IFN-γ level（27.69±7.64 ng/L vs.9.75±2.81 ng/L,t=4.237,P＜0.01）.Moreover,miRNA-146a expression was positively correlated with plasma IFN-γ level in the patients（r=0.837,P＜0.01）.After 24-hour culturein vitro,there was a significant increase in the number of Th1 cells,protein and mRNA expressions of T-bet,and supernatant level of IFN-γ,but a significant decrease in the protein expression of IFN-γRα in the miRNA-146a group compared with the control group（all P＜0.01）.However,no significant differences were observed in the number of Th2 cells,mRNA or protein expressions of GATA-3,or supernatant level of IL-4 among the control group,miRNA-146a group and miRNA-146a inhibitor group （allP＞0.05）.ConclusionmiRNA-146a may play an important role in the pathogenesis of psoriasis vulgaris by participating in the regulation of peripheral blood CD4+T lymphocytes via affecting Th1 cell differentiation and function.

Psoriasis;RNA;T-lymphocytes,helper-inducer;Interferon-gamma;Interleukin-4;MicroRNAs

Wei Ming,Email:gushiweiming@126.com

魏明，Email：gushiweiming@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.04.004

2015-08-04）

（本文編輯：尚淑賢）