銀屑病調節性T細胞的功能異常及STAT3通路調控機制研究

楊璐婷 李冰 張倩 黨二樂 王剛

710032西安，第四軍醫大學西京皮膚醫院

·論著·

銀屑病調節性T細胞的功能異常及STAT3通路調控機制研究

楊璐婷 李冰 張倩 黨二樂 王剛

710032西安，第四軍醫大學西京皮膚醫院

目的 研究銀屑病患者外周血調節性T細胞（Treg）的功能，探討與功能異常相關的STAT3信號通路機制。方法 尋常性銀屑病患者81例，銀屑病面積和嚴重度指數（PASI）評分10～30，均為慢性斑塊狀。對照組46例，為健康獻血者。采用流式細胞儀檢測外周血中Treg細胞的比例，用體外淋巴細胞混合培養方法檢測銀屑病患者和健康人外周血中Treg細胞的增殖活性及對效應性T細胞（Tresp）的抑制功能，用流式細胞儀及qRT-PCR檢測Treg細胞中磷酸化STAT3的比例及分泌促炎因子干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素17（IL-17）的水平。最后，用STAT3通路抑制劑Stattic V處理銀屑病患者Treg細胞，觀察其增殖及抑制功能的恢復及分泌促炎因子的變化。結果 銀屑病患者組外周血Treg細胞數量（6.437%±0.186%）與對照組（6.812%±0.241%）比較差異無統計學意義（t=1.224，P＞0.05），但銀屑病患者組外周血Treg細胞增殖活性及對Tresp細胞的抑制功能明顯降低，磷酸化STAT3表達水平顯著升高，分泌促炎因子IFN-γ、TNF-α、IL-17的水平顯著升高（均P＜0.05）。經50 μg/L Stattic V作用后，銀屑病患者Treg細胞對Tresp抑制率為61.670%±4.640%，未處理組為28.820%±11.490%，兩組差異有統計學意義（P＜0.05）；50 μg/L Stattic V作用后，促炎因子IFN-γ、TNF-α、IL-17 mRNA表達量（2-△△Ct）分別為1.654±0.879、0.850±0.705、0.572±0.135，均顯著低于未處理組（分別為23.350±6.721、4.847±1.525、3.095±0.650），差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論 銀屑病患者Treg細胞對Tresp細胞的負向調控功能降低，其機制與STAT3信號通路異常活化有關，抑制STAT3通路的活化有可能一定程度地恢復Treg細胞功能。

銀屑病；T淋巴細胞，調節性；STAT3轉錄因子；干擾素γ；腫瘤壞死因子α；白細胞介素17；Stattic V

調節性 T 細胞（regulatory T cells，Treg）是一群具有負向免疫調節功能的細胞，在維持免疫穩態和免疫耐受中發揮重要的作用［1］。銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，發病機制復雜，目前普遍認為，T細胞活化是銀屑病發病的中心環節［2-3］。近來研究發現，銀屑病患者Treg細胞可能存在數量或功能的異常，參與銀屑病的發生與發展，然而其具體的異常情況及其機制仍不明確。我們通過檢測銀屑病患者外周血Treg細胞的比例及其信號轉導與轉錄因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）活性，分析Treg細胞自身增殖和對效應性T 細胞（responder T cells，Tresp）的抑制作用，探討Treg細胞在銀屑病發病中的作用及其機制。

材料和方法

1.臨床資料：西京皮膚醫院2014年3月至2015年2月明確診斷為尋常性銀屑病患者81例，男47例，女34例，年齡20～45歲，平均33歲，所有患者均為活動期，PASI評分10～30，4周內未接受免疫抑制劑和外用藥物治療。46例健康志愿者作為對照組，男28例，女18例，年齡20～40歲，平均28歲。本研究經患者知情同意及第四軍醫大學西京醫院倫理委員會批準。

2.主要儀器與試劑：分選用流式細胞儀（美國Beckman公司），鑒定用流式細胞儀（美國BD公司），激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司），流式抗體 CD3-FITC、CD4-APC/Cy7、CD25-PE、CD25-FITC、CD127-FITC、Foxp3-APC、pSTAT3-PE、干擾素 γ（IFN-γ）-PE、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）-PE、白細胞介素 17（IL-17）A-PE（美國 Biolegend 公司），T細胞活化混合劑（美國BD公司），細胞固定/破膜液（美國eBioscience公司），Stattic V（美國Santa Cruz公司），CFSE（美國 Life Technologies公司），重組人白細胞介素 2（IL-2，美國 Peprotech公司），CD3單抗（美國eBioscience公司），兔抗人pSTAT3抗體、FITC-羊抗兔熒光二抗（英國的Abcam公司）。

3.外周血Treg細胞數量檢測：以CD4+CD25+Foxp3+為標記檢測Treg細胞。抽取每例受試者靜脈血20 ml，加入肝素抗凝管，用淋巴細胞分離液分離人外周血單個核細胞后，進行表面熒光抗體染色，將培養細胞加入到流式檢測管，每管加入CD3-FITC、CD4-APC/Cy7、CD25-PE 各 5 μl，空白管中加入相同量的流式抗體，4℃孵育30 min，加入2 ml無菌PBS離心，固定液室溫避光固定反應30 min后離心棄上清液，PBS洗滌1次，測試管加入破膜劑打孔，離心后棄上清液，測試管加入Foxp3-APC 5 μl，4℃孵育1 h。流式細胞儀各參數設置完畢之后，對Treg細胞占CD4+T細胞的比例進行檢測。

4.Treg細胞和Tresp細胞的分離：同上述方法分離得到的外周血單個核細胞進行表面熒光抗體染色，將培養細胞加入到流式檢測管，每管中加入CD4-APC/Cy7、CD25-PE、CD127-FITC 各 5 μl，空白管中加入相同量的流式抗體，4℃孵育30 min，加入2 ml無菌PBS，209×g離心5 min，棄上清液。加入1 ml無菌PBS，上機分選。分別收集CD4+CD25+CD127-的 Treg細胞和 CD4+CD25-CD127+的 Tresp細胞。

5.Treg細胞增殖及免疫抑制功能檢測：將流式分選得到的Treg細胞進行CFSE染色，每個流式管加入1 ml無菌PBS溶液，5 μmol/L CFSE室溫避光孵育15 min，加入RPMI 1640培養基終止反應，209×g離心5 min，棄上清液。將5×104CFSE染色的Treg細胞接種于5 mg/L CD3包被的96孔U型板，每組設3孔。加入50 μg/L的IL-2刺激Treg細胞活化。7 d后，流式細胞儀檢測Treg細胞增殖比例。將5×104CFSE染色的Tresp細胞、5×104Treg細胞單獨及兩者按照1∶1的比例接種于5 mg/L CD3包被的96孔U型板，每組設3孔。加入50 μg/L的IL-2刺激Tresp細胞活化。7 d后，流式細胞儀檢測Tresp細胞增殖比例。抑制率=［1-（兩種T細胞共培養Tresp的增殖率/Tresp單獨培養的增殖率）］×100%。

6.Treg細胞中pSTAT3比例及分泌促炎因子水平檢測：將分離得到的外周血單個核細胞培養于6孔板，加入T細胞活化混合劑1μl，37℃培養4～6h。加入CD4-APC/Cy7、CD25-FITC進行表面抗體染色，固定破膜后加入 Foxp3-APC 5 μl，4 ℃孵育 30 min，分別加入 pSTAT3-PE、IFN-γ-PE、TNF-α-PE、IL-17A-PE 5 μl，4 ℃孵育 30 min。流式細胞儀檢測pSTAT3及分泌促炎因子的比例變化。

7.STAT3抑制劑對Treg細胞增殖及抑制功能的作用檢測：在5×104CFSE染色的銀屑病患者Treg細胞培養的96孔U型板中，加入10和50 μg/L的Stattic V，7 d后，流式細胞儀檢測銀屑病患者Treg細胞增殖率的變化。在5×104CFSE染色的銀屑病患者Tresp細胞、5×104Treg細胞混合培養的96孔U型板中，分別加入10和50 μg/L的Stattic V，7 d后，流式細胞儀檢測銀屑病患者Treg細胞抑制率的變化。

8.實時RT-PCR檢測Treg細胞分泌炎癥因子的水平：用Trizol試劑提取CD4+CD25+CD127-Treg細胞總RNA。用逆轉錄試劑盒進行cDNA逆轉錄，并以此模板進行qRT-PCR檢測。qRT-PCR擴增條件：95℃預變性 1 min，95℃變性 5 s，59℃退火 30 s，72℃延伸30 s，40個循環，72℃延伸10 min。每次反應設3個復孔。反應結束后采用Thermal cycler軟件包計算Ct值，分析熒光強度。mRNA相對表達量采用2-△△Ct表示。根據Primer Premier 5.0軟件設計各目的基因的特異性引物，引物設計跨越外顯子。IFN-γ 上游引物：5′-GACCAGAGCATCCAAAAGA G-3′，下游引物 5′-GAGTTCATGTATTGCTTTGCG-3′，擴增產物長度153 bp。TNF-α上游引物：5′-GGTCT ACTTTGGGATCATTGCC-3′，下游引物 5′-GTTCTA AGCTTGGGTTCCGAC-3′，擴增產物長度163 bp。IL-17A 上游引物：5′-CGGCTGGAGAAGATACTGG T-3′，下游引物 5′-TTAGTCCGAAATGAGGCTGTC-3′，擴增產物長度172 bp。內參照為β肌動蛋白，上游引物：5′-GGCTACAGCTTCACCACCAC-3′，下游引物 5′-TGCGCTCAGGAGGAGC-3′，擴增產物長度418 bp。

9.統計學分析：采用Graphpad Prism統計軟件分析并作圖，數據以±s表示，各組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.銀屑病患者外周血Treg細胞比例無明顯變化：對照組外周血中CD4+CD25+Foxp3+占CD4+淋巴細胞的6.812%±0.241%，銀屑病患者組為6.437%±0.186%，兩組差異無統計學意義（t=1.224，P＞ 0.05），見圖1。

圖1 銀屑病患者外周血調節性T細胞（Treg細胞）比例 1A：流式細胞圖顯示銀屑病及健康對照外周血CD3+CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞占CD4+T細胞比例的變化。1B：46例健康對照和81例銀屑病患者Treg細胞比例統計結果圖

2.銀屑病患者Treg細胞增殖及對Tresp細胞抑制功能減弱：對照組Treg細胞體外增殖率為64.700%±7.022%，銀屑病患者組為27.620%±5.173%，銀屑病患者組Treg細胞增殖功能顯著降低（t=4.034，P＜0.01）。在體外Treg細胞和Tresp細胞共培養時發現，對照組Treg細胞對Tresp的抑制率為56.280%±6.305%，而銀屑病組僅為22.670%±4.928%，兩組比較，t=4.044，P＜ 0.01。見圖2。

3.銀屑病患者Treg細胞磷酸化STAT3比例升高，分泌炎癥因子水平升高：流式細胞儀檢測發現，銀屑病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞中pSTAT3的比例、分泌 IFN-γ、TNF-α、IL-17的比例均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。qRT-PCR檢測同樣發現，銀屑病患者外周血Treg細胞表達 IFN-γ、TNF-α、IL-17 mRNA 水平顯著高于對照組（均P＜0.05）。見表1。

4.STAT3抑制劑能顯著恢復銀屑病Treg細胞抑制功能并降低炎癥因子的表達：加入10 μg/L的Stattic V于銀屑病患者外周血Tresp和Treg共培養體系中，Treg細胞對Tresp的抑制率與未處理組相比，差異無統計學意義（t=0.784，P＞0.05）；當加入50μg/L的Stattic V 處理后，銀屑病患者Treg細胞對Tresp的抑制率顯著高于未處理組，差異有統計學意義（t=2.787，P＜0.05）。見圖3。而不同濃度Stattic V處理銀屑病患者Treg細胞后，Treg細胞增殖功能無明顯改變（t值依次為 0.004、0.106，均P＞ 0.05）。見圖4。50 μg/L的Stattic V作用于銀屑病患者外周血Treg細胞后，炎癥因子 IFN-γ、TNF-α、IL-17 mRNA表達量均較銀屑病未處理組降低，差異有統計學意義（t值依次為3.721、3.565、4.267，均P＜ 0.05）。見圖5。

圖2 流式細胞儀檢測銀屑病患者外周血調節性T細胞（Treg細胞）與效應性T細胞（Tresp細胞）共培養體系中Tresp細胞增殖率及Treg細胞抑制率 2A：流式細胞儀檢測Tresp細胞增殖率；2B：2A的柱狀統計圖；2C：Treg細胞抑制率，銀屑病患者Treg細胞抑制Tresp細胞增殖能力顯著低于健康對照，P＜0.01

圖3 STAT3抑制劑（Stattic V）對銀屑病患者外周血調節性T細胞（Treg細胞）和效應性T細胞（Tresp細胞）共培養體系中Treg細胞的抑制率 加入10 μg/L Stattic V組Treg細胞抑制率與未加Stattic V的對照組相比，差異無統計學意義；加入50 μg/L Stattic V組則顯著高于對照組（P＜0.05）

圖4 STAT3抑制劑（Stattic V）對銀屑病患者外周血調節性T細胞（Treg細胞）的增殖率 Stattic V處理Treg細胞后不能恢復其增殖功能

表1 銀屑病患者外周血調節性T細胞（Treg細胞）pSTAT3比例及分泌炎癥因子的細胞比例和mRNA表達水平（±s）

表1 銀屑病患者外周血調節性T細胞（Treg細胞）pSTAT3比例及分泌炎癥因子的細胞比例和mRNA表達水平（±s）

注：IFN-γ：干擾素 γ；TNF-α：腫瘤壞死因子 α；IL-17：白細胞介素 17

組別例數在CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞中所占比例（%）Treg細胞表達炎癥因子mRNA水平（2-△△Ct）pSTAT3 IFN-γ TNF-α IL-17 IFN-γ mRNA TNF-α mRNA IL-17 mRNA銀屑病組 81 64.580±6.223 9.174±1.443 8.473±1.502 5.378±0.708 23.350±6.721 4.847±1.525 3.095±0.650對照組 45 37.750±1.996 0.749±0.081 1.038±0.113 2.367±0.910 1.014±0.004 1.013±0.003 1.020±0.006 t值 3.848 5.829 4.935 2.532 3.617 2.515 2.697 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

討 論

Treg細胞是一群可負向調控機體免疫反應的CD4+T細胞，對于維持機體免疫耐受和免疫應答穩態具有非常重要的作用。在健康人外周血中，Treg細胞占CD4+T細胞的比例約為5%～10%。雖然其在外周血中所占比例較小，但卻能顯著抑制自身反應性T細胞的過度增殖和活化。研究表明，Treg細胞數量上的變化和（或）功能異常參與多種自身免疫性疾病的發生發展，例如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、銀屑病等［4-8］。

圖5 50 μg/L Stattic V作用于銀屑病患者外周血調節性T細胞（Treg細胞）后炎癥因子干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素17（IL-17）mRNA表達量（2-△△Ct）銀屑病患者Treg細胞加Stattic V組IFN-γ、TNF-α和IL-17 mRNA表達水平顯著低于銀屑病未處理組，均P＜0.05

關于Treg細胞在銀屑病患者皮損及外周血中數量和功能的變化，目前研究結果并不一致。部分研究認為，銀屑病患者外周血中Treg細胞的變化與銀屑病的嚴重程度及疾病分期密切相關。Yan等［9］發現，在進展期尋常性銀屑病患者外周血中Treg細胞的數量明顯低于穩定期和消退期，消退期明顯高于穩定期，并且其所占CD4+T細胞的比例與患者的PASI評分及疾病嚴重程度呈明顯正相關。而Chen等［10］研究發現，中度銀屑病患者外周血中Treg細胞數量與健康對照無明顯差異，而重度銀屑病患者外周血中Treg細胞數量明顯低于正常人。我們通過流式細胞儀分析了81例中重度銀屑病患者及46例健康對照外周血中Treg細胞數量的變化，發現銀屑病患者外周血Treg細胞數量未發生明顯變化，該結果與Sugiyama等［11］研究結果一致。目前學術界對銀屑病患者外周血中Treg細胞的數量變化仍存在爭議，而研究結果的差異也主要歸因于以下幾個方面：①病例數量的差異；②銀屑病患者的疾病嚴重程度及分期不同；③因Treg細胞有不同種類的分型，其分子標志物各不相同，使得研究結果各異。本研究通過檢測較大的臨床樣本量，選擇特異性的分子標志，所得到的結果更準確地反映了銀屑病患者Treg細胞數量和比例狀態。

我們首先證實了銀屑病患者外周血Treg細胞自身增殖活性減弱，同時還發現，銀屑病患者Treg細胞對Tresp細胞的抑制增殖作用減弱，提示Treg細胞功能的紊亂參與了銀屑病的發病。

STAT3通路可以調控細胞增殖、分化，影響細胞因子分泌。近年來，有學者在銀屑病患者皮損處檢測到激活的 STAT3。Sano 等［12-13］研究發現，銀屑病患者皮損處角質形成細胞中pSTAT3的表達顯著高于健康人，在K5.STAT3c轉基因小鼠模型中STAT3處于持續激活狀態，且小鼠的皮損及組織病理學改變均與銀屑病類似，提示STAT3通路的持續激活可能影響自身免疫穩態，導致銀屑病樣改變。另有研究發現，STAT3可以通過抑制Foxp3的表達影響Treg細胞的發育，降低 Foxp3+Treg 細胞數量［14］。因此我們推測，在銀屑病患者Treg細胞中，STAT3通路的活化狀態發生改變，導致銀屑病患者Treg細胞抑制功能異常。我們通過流式細胞儀證實，銀屑病患者外周血Treg細胞STAT3通路過度活化，高表達pSTAT3。當使用STAT3抑制劑作用后，銀屑病患者Treg細胞對Tresp抑制增殖作用有明顯恢復，進一步證實STAT3通路異常活化是銀屑病患者Treg細胞功能異常的重要分子機制。

正常情況下，Treg細胞主要通過分泌IL-10、TGF-β等發揮免疫抑制作用，不表達或表達低水平的炎癥因子 IFN-γ、TNF-α、IL-17等。Th17細胞是產生IL-17的T細胞亞群，介導一系列炎癥反應，Treg細胞則發揮免疫抑制功能，限制過度的免疫應答，兩者的平衡有利于免疫穩態的維持。近年來研究發現，Treg細胞向Th17細胞的轉換可能是Treg細胞功能異常的重要分子機制［15］。我們在銀屑病患者Treg細胞中檢測到高比例IL-17+CD25+Foxp3+的三陽性細胞，并首次在Treg細胞中檢測到高比例IFN-γ+CD25+Foxp3+三陽性細胞，提示銀屑病患者體內Treg細胞向分泌IL-17細胞及IFN-γ細胞轉變的可能，進而加重炎癥反應。

本研究首次發現STAT3通路參與了銀屑病患者Treg細胞抑制功能的改變，與此同時發現銀屑病患者Treg細胞可能存在功能轉換，通過分泌促炎因子加重炎癥反應，為深入了解銀屑病Treg細胞功能缺陷的分子機制奠定了基礎。

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Dysfunction of regulatory T cells in patients with psoriasis and related mechanisms of regulation by the STAT3 signaling pathway

Yang Luting,Li Bing,Zhang Qian,Dang Erle,Wang Gang
Department of Dermatology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China

ObjectiveTo evaluate the function of regulatory T （Treg）cells in peripheral blood from patients with psoriasis,and to explore the possible role of the STAT3 signaling pathway in Treg cell dysfunction.MethodsTotally,81 patients with psoriasis vulgaris,who all presented with chronic plaques and had a psoriasis area and severity index（PASI）score of 10-30,were enrolled into this study.Forty-six healthy blood donors served as the control group.Venous blood samples were collected from these subjects followed by isolation of Treg cells and responder T （Tresp）cells.Flow cytometry was performed to determine the proportion of Treg cells in peripheral blood as well as that of cells secreting phosphorylated-STAT3（p-STAT3）,interferon γ（IFN-γ）,tumor necrosis factor α（TNF-α）and interleukin 17（IL-17）in Treg cells,and quantitative real-time PCR （qRT-PCR）to measure the expression levels of IFN-γ,TNF-α and IL-17 mRNAs in Treg cells.Some Treg cells and Tresp cells were culturedin vitroalone or in combination,and flow cytometry was conducted to estimate cellular proliferative activity on day 7 after stimulation with IL-2.Some patient-derived Treg cells were classified into several groups to be cultured alone or in combination with Tresp cells with or without the presence of the STAT3 pathway inhibitor,Stattic V （10 or 50 μg/L）,for 7 days.Subsequently,flow cytometry was performed to evaluate the proliferative activity of Tresp cells,and qRT-PCR to measure the expression levels of IFN-γ,TNF-α and IL-17 mRNAs in Treg cells.ResultsNo significant differences were observed in the proportion of Treg cells in peripheral blood between the patient group and control group（6.437%±0.186%vs.6.812%±0.241%,t=1.224,P＞0.05）.Compared with control-derived Treg cells,the patient-derived Treg cells showed significantly decreased proliferative activity and inhibitory effects on Tresp cells,but increased proportion of cells secreting p-STAT3,IFN-γ,TNF-α and IL-17 （allP＜ 0.05）.After the treatment with 50 μg/L Stattic V,a significant increase was observed in the inhibitory effect of patient-derived Treg cells on Tresp cells（inhibition rate:61.670%±4.640%vs.28.820%±11.490%,P＜ 0.05）,but a significant decrease in the mRNA expressions of IFN-γ （2-△△Ct:1.654 ± 0.879 vs.23.350 ± 6.721,P＜0.05）,TNF-α（0.850±0.705 vs.4.847±1.525,P＜0.05）and IL-17（0.572±0.135 vs.3.095±0.650,allP＜0.05）in patient-derived Treg cells compared with untreated patient-derived Treg cells.ConclusionsThe negative regulatory effect of Treg cells on Tresp cells is decreased in patients with psoriasis,which may be associated with abnormal activation of the STAT3 signaling pathway,and inhibition of the pathway may restore the function of Treg cells to a certain extent.

Psoriasis;T-lymphocytes,regulatory;STAT3 transcription factor;Interferon-gamma;Tumor necrosis factor-alpha;Interleukin-17;Stattic V

Wang Gang,Email:xjwgang@fmmu.edu.cn

王剛，Email：xjwgang@fmmu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.04.002

國家自然科學基金（81430073、81301349）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81430073,81301349）

2016-01-26）

（本文編輯：顏艷）