杏仁黃酮的提取及抗氧化活性的研究

黃麗華，邵玲，李蕓瑛

（肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東肇慶526061）

杏仁黃酮的提取及抗氧化活性的研究

黃麗華，邵玲，李蕓瑛

（肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東肇慶526061）

以南杏、北杏和美國(guó)大杏仁為材料，通過(guò)超聲波輔助提取法提取黃酮，比較這3種杏仁中黃酮的含量，結(jié)果：美國(guó)大杏仁總黃酮含量最高、南杏次之、北杏最低。通過(guò)3種杏仁的黃酮提取物對(duì)清除羥自由基（·OH），超氧陰離子自由基（O2-·）和DPPH·自由基的清除能力并與維生素C作比較，研究分析其抗氧化活性，結(jié)果表明3種杏仁都具有較強(qiáng)的清除自由基的能力，其中對(duì)DPPH·自由基的清除能力比維生素C還要強(qiáng)。

杏仁；黃酮；抗氧化活性

杏仁，屬于薔薇科落葉喬木杏、山杏、野杏成熟果實(shí)的核仁，是常用的中藥之一，杏仁分為兩種，藥用多用苦杏仁（俗稱(chēng)北杏仁），它性微溫，味苦，可降氣平喘止咳，潤(rùn)腸通便，但略微有毒性，不可多服；食用的多為甜杏仁（俗稱(chēng)南杏仁）。而美國(guó)大杏仁在中醫(yī)中不作藥用，但是其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，體內(nèi)富含多種蛋白質(zhì)、維生素及微量元素，特別是含有大量的維生素E和黃酮類(lèi)化合物，有很強(qiáng)的抗氧化作用［1］。杏仁富含黃酮類(lèi)和多酚類(lèi)成分，是降低人體膽固醇的不錯(cuò)中藥，黃酮類(lèi)化合物有預(yù)防心臟病和減少心肌梗塞的作用，因此，常食杏脯、杏干，對(duì)心臟病患者有一定好處［2］。它能夠增加腦血管流量，改善腦血管循環(huán)功能，保護(hù)腦細(xì)胞，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，防止心絞痛及心肌梗塞，防止血栓形成，提高機(jī)體免疫能力［3］。對(duì)冠心病、心絞痛、腦動(dòng)脈硬化、老年性癡呆、高血壓病人均十分有益。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)杏仁黃酮的研究報(bào)道相對(duì)還比較少，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)美國(guó)大杏仁、南杏和北杏3種杏仁中黃酮的提取及其清除自由基的能力的比較，旨在通過(guò)體外試驗(yàn)體系研究3種杏仁中黃酮類(lèi)化合物的抗氧化活性，為杏仁中黃酮類(lèi)化合物作為天然抗氧化劑和功能性食品的開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

杏仁（美國(guó)大杏仁、南杏、北杏）：均采購(gòu)于肇慶市二馬路批發(fā)市場(chǎng)，粉碎，脫脂，烘干。

水楊酸（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）、鹽酸奈乙二胺（分析純）、DPPH（分析純）、過(guò)氧化氫（分析純）：均購(gòu)自廣州威佳公司。

1.2儀器

FA2004A電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；ZKJ-1型真空泵：上海嘉鵬科技有限公司；UA-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；KJ1012B超聲波清洗器：廣州市番禺科進(jìn)超聲波設(shè)備廠。

1.3方法

1.3.1杏仁黃酮提取工藝流程

杏仁粉末→加乙醇→超聲波處理→抽濾→定容→黃酮提取液

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取南杏、北杏和美國(guó)大杏仁粉末各5 g于三角燒瓶中，按料液比1∶20（g/mL）分別加60%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，震蕩使其得到充分混勻，在75℃溫度下超聲波輔助提取2 h，再抽濾得到的提取液用60%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液定容至100 mL的容量瓶中作為待測(cè)液［4］。

1.3.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)110℃干燥至恒重的的蘆丁樣品20mg于50 mL的容量瓶中，用60%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液溶解，定容，充分搖勻，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取該標(biāo)準(zhǔn)液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置于25 mL的容量瓶中，加5%的亞硝酸鈉溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min，再加5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硝酸鋁溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min，加1 mol/mL的氫氧化鈉溶液5 mL，最后用60%定容至刻度，搖勻，靜置5 min，以第一管為空白，在510 nm處測(cè)其吸光度［5］。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，見(jiàn)圖1。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Rutin standard curve

1.3.3提取液中黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取0.5 mL的提取液，按方法2.2測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3種提取物的總黃酮含量。

1.3.4對(duì)羥（·OH）自由基清除作用的測(cè)定

采用分光光度法及甲基Fe2++H2O2反應(yīng)體系［6］：取3個(gè)5 mL容量瓶，分別依次加進(jìn)0.05 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液1.0mL，0.02g/L亞甲藍(lán)0.5mL，2mmol/L FeSO4溶液0.50 mL，再分別加入樣品提取液1.0 mL，0.5%過(guò)氧化氫溶液0.5 mL，蒸餾水稀釋至刻度。37℃水浴加熱反應(yīng)60 min，在664 nm處測(cè)定其吸光度（A加樣），在其他條件不變的情況下，分別再用蒸餾水來(lái)代替樣品提取液測(cè)得的吸光度為空白吸光度（A損傷）。以不加H2O2和樣品溶液測(cè)定（A未損傷），同時(shí)用等質(zhì)量濃度的的VC代替樣品做陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.5對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用

采用在弱堿條件下鄰苯三酚自氧化法測(cè)定樣品清除超氧陰離子自由基的活性［7］：取4.5 mL的pH為8.2的0.05 mol/L的Tris-HCl溶液，置于25℃水浴中加熱30 min，分別加入1.0 mL試樣和3 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.4 mL，混勻，在25℃水浴中5 min，加入8 mol/L的鹽酸0.5 mL終止反應(yīng)，于318 nm處測(cè)定吸光度（A樣）。空白對(duì)照（A0）以相同體積的蒸餾水代替樣品。同時(shí)用等質(zhì)量濃度的VC代替樣品做陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.6對(duì)DPPH·自由基的清除作用

按照表1的要求添加反應(yīng)液［8］。

表1　樣品試劑添加方法Table 1Sample reagent adding methods

DPPH·自由基清除能力的公式：DPPH·清除率/%=［1-（Ai-Aj）］/A0×100

試驗(yàn)重復(fù)3次，求平均值。

2　結(jié)果與分析

2.13種杏仁中總黃酮的含量

用超聲波輔助法提取3種杏仁中的黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　杏仁中黃酮含量Table 2Flavonoid in the amygdala

試驗(yàn)結(jié)果表明：3種杏仁中黃酮含量：美國(guó)大杏仁＞南杏＞北杏，其中美國(guó)大杏仁總黃酮含量達(dá)到1.58 g/100 g，大于另外兩種杏仁。

2.2清除自由基活性比較

2.2.1對(duì)羥自由基的清除作用

羥自由基（·OH）是一種氧化能力很強(qiáng)的自由基，它能夠很容易地氧化各種生物大分子，氧化效率高，反應(yīng)速率快，是造成組織脂質(zhì)過(guò)氧化、核酸斷裂、蛋白質(zhì)和多糖分解的一種活性氧自由基，與機(jī)體的衰老、腫瘤發(fā)生發(fā)展、輻射損傷和細(xì)胞吞噬有關(guān)［9］。

杏仁黃酮提取液對(duì)羥自由基清除結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　杏仁黃酮提取液對(duì)·OH的清除作用Fig.2Almond extract flavonoids on·OH scavenging effect

由圖2可知，杏仁有較強(qiáng)的清除作用，當(dāng)3種杏仁在提取液質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥自由基的清除效果較明顯，3者當(dāng)中美國(guó)大杏仁對(duì)羥自由基的清除率最大，為58.21%，南杏為43.78%，北杏為41.89%，但在其它條件不變條件下，與相同質(zhì)量濃度的維生素C相比，3者均小于維生素C的清除率，維生素C對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到89.88%。

2.2.2對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

超氧陰離子自由基（O2-·）具有毒性作用，是人體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基，可以引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，加快肌體的衰老過(guò)程，并可誘發(fā)癌癥、心血管疾病等，嚴(yán)重危害人體健康［7］。

3種杏仁和維生素C對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　杏仁黃酮提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.3Almond extract flavonoids on the ultra oxygen anion free radical scavenging effect

由圖3可知，當(dāng)這3種杏仁在提取液質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基清除作用明顯，美國(guó)大杏仁的清除率最大為54.80%，南杏和北杏相對(duì)較小，分別為45.62%和42.00%，與維生素C相比，3者都小于維生素C，維生素C對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為67.19%。

2.2.3對(duì)DPPH·自由基的清除作用

二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，通過(guò)檢測(cè)抗氧化劑對(duì)DPPH·的清除能力可以表示其抗氧化性的強(qiáng)弱。其甲醇溶液在518 nm處有最大吸收，當(dāng)與抗自由基的活性物質(zhì)作用時(shí)，其吸收峰值會(huì)降低很多，吸收的峰值越低表明抗自由基活性物質(zhì)的活性越強(qiáng)［8］。

DPPH·測(cè)定的機(jī)理可能是DPPH·使待測(cè)有機(jī)物形成不穩(wěn)定的自由基中間體，進(jìn)而雙分子偶聯(lián)形成穩(wěn)定的最終產(chǎn)物［10］。3種杏仁和維生素C對(duì)DPPH·的清除作用結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　杏仁黃酮提取液對(duì)DPPH·的清除作用Fig.4Almond extract flavonoids on DPPH·scavenging effect

由圖4可知，提取液質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，美國(guó)大杏仁對(duì)DPPH·的清除率最大為95.46%，南杏92.71%，北杏92.08%，維生素C對(duì)DPPH·的清除率為90.13%，3種杏仁對(duì)DPPH·的清除率都大于維生素C。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)利用超聲輔助法［提取時(shí)間2 h，提取溫度75℃，料液比1∶20（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)60%］提取杏仁中的黃酮，確定了美國(guó)大杏仁，南杏和北杏這3種杏仁中總黃酮含量，結(jié)果顯示，3種杏仁都含有較多的黃酮，總黃酮含量：美國(guó)大杏仁（1.58 g/100 g）＞南杏（1.14 g/100 g）＞北杏（1.07 g/100 g）。

試驗(yàn)測(cè)定杏仁提取物對(duì)羥自基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）和DPPH·3種自由基清除作用并與維生素C作對(duì)比。結(jié)果表明，在提取液濃度為1.0 mg/mL時(shí)，3種杏仁都具有較強(qiáng)的抗氧化活性，從DPPH的清除效果來(lái)看，對(duì)DPPH·自由基清除作用較強(qiáng)，均超過(guò)92%，美國(guó)大杏仁清除作用最強(qiáng)，達(dá)到95.46%，3種杏仁對(duì)DPPH的清除作用都超過(guò)了維生素C，美國(guó)大杏仁、南杏和北杏對(duì)羥自由基（·OH）及超氧陰離子自由基（O2-·）都有較強(qiáng)的清除作用，但均弱于VC。

可見(jiàn)杏仁中黃酮類(lèi)化合物是一種很好的抗氧化劑，其體內(nèi)黃酮含量較為豐富，可作為天然的抗衰老保健品，綠色食品抗氧化劑，在天然抗氧化劑和醫(yī)藥保健先關(guān)領(lǐng)域具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。

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Extraction and Antioxidant Activity of Flavonoids from Almond

HUANG Li-hua，SHAO Ling，LI Yun-ying
（College of Life Science，Zhaoqing University，Zhaoqing 526061，Guangdong，China）

The contents of flavonoids were extracted by ultrasonic assisted extraction method，and the contents of flavonoids in three kinds of almonds were compared.The scavenging ability of three kinds of extracts offlavonoids in the extract of hydroxyl radical（·OH），superoxide radical（O2-·）and DPPH free radical scavenging activity was compared with that of vitamin C.The results showed that three kinds of almond had strong ability to remove free radicals，and the scavenging ability of DPPH free radical was stronger than that of vitamin C.

almond；flavonoids；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.016

黃麗華（1972—），女（漢），高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，學(xué)士，研究方向：植物生理生化及食品營(yíng)養(yǎng)成分分析。

2015-12-14