基于抗氧化活性的豆豉多糖提取工藝優(yōu)化

吳蘭芳，蔣愛民，鄭開顏，林敏浩，黃洪媛

（1.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北石家莊050200；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642；3.貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院輕工化工系，貴州貴陽550025）

基于抗氧化活性的豆豉多糖提取工藝優(yōu)化

吳蘭芳1，2，蔣愛民2，鄭開顏1，林敏浩2，黃洪媛3，*

（1.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北石家莊050200；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642；3.貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院輕工化工系，貴州貴陽550025）

以DPPH自由基清除能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)米曲霉型豆豉多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并利用苯酚硫酸法對(duì)其糖含量進(jìn)行測(cè)定。利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)米曲霉型豆豉多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定其最優(yōu)提取條件為：提取溫度90℃，提取時(shí)間1 h，料液比1∶10（g/mL），乙醇沉淀濃度70%。在此條件下，豆豉多糖的抗氧化能力最強(qiáng)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)64.21%，糖含量為88.93%。

米曲霉型豆豉；多糖；提取工藝；抗氧化

豆豉是我國傳統(tǒng)的大豆的發(fā)酵制品，以黑褐色或黃褐色、鮮美可口、咸淡適中、回甜化渣、具豆豉特有豉香氣者為佳。豆豉含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物，還含有多種礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)［1-2］。豆豉按制曲發(fā)酵時(shí)所參與的主要微生物種類的不同，豆豉可分為米曲霉型、毛霉型、根霉型、細(xì)菌型。本文所采用的原料為陽江豆豉，其為米曲霉型豆豉的典型代表［3］。

多糖又稱多聚糖，由存在于自然界的醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，是一切有生命的有機(jī)體必不可少的成分［4］。許多研究證明許多天然食品中的多糖是具有清除自由基和代謝調(diào)節(jié)作用的天然物質(zhì)［5］。目前對(duì)于米曲霉型豆豉的研究集中于菌株的分離與鑒定、發(fā)酵工藝的研究、活性成分的提取等方面［6-8］，而對(duì)于以抗氧化為指標(biāo)，優(yōu)化米曲霉型豆豉多糖的提取工藝鮮見報(bào)道，因此本試驗(yàn)擬以米曲霉型豆豉為原料，以DPPH自由基的清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)篩選陽江豆豉多糖的最優(yōu)提取工藝，以期為豆豉作為保健品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)及科學(xué)參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豆豉：廣東陽江市陽帆豆豉廠；硫酸（分析純）、鹽酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、無水乙醇（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；維生素C（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二苯代苦味基肼自由基（DPPH）（分析純）：百靈威公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

PL203型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；PHS-3精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)：島津儀器有限公司；冷凍高速離心機(jī)5804R：德國艾本德儀器公司。

1.3方法

1.3.1豆豉多糖的提取［9］

豆豉粉碎過60目篩于60℃烘箱烘干，干粉用80%乙醇溶液回流提取2次，減壓濃縮回收乙醇后，殘?jiān)L(fēng)干得脫脂豆豉干粉，保存?zhèn)溆谩?/p>

取經(jīng)預(yù)處理的脫脂豆豉干粉，加入蒸餾水后水浴加熱提取。提取后于4 000 r/min離心15 min，收集上清液，殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄖ貜?fù)提取2次。合并上清液減壓濃縮至一定體積，向濃縮液中加入一定濃度的乙醇，沉淀完全后過濾，真空干燥后得到粗多糖。

1.3.2抗氧化活性評(píng)價(jià)［10-11］

選取DPPH自由基清除能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)豆豉多糖進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)。取0.1 g豆豉多糖，加入10 mL蒸餾水，取3 mL溶液，向樣液中加入3 mL 0.16 mmol/L DPPH溶液，于25℃水浴中放置15 min后，在517 nm測(cè)得試樣吸光度（Ai），取3 mL蒸餾水代替樣品測(cè)得空白吸光度（A0），向3 mL樣品中加入3 mL蒸餾水測(cè)得樣品本底吸光度（Aj），其中（Ai）每個(gè)樣品質(zhì)量濃度做3個(gè)平行，取平均值。以維生素C作陽性對(duì)照，按下列公式計(jì)算清除率。清除率/%=［A0-（Ai-Aj）］/ A0×100。

1.3.3基于抗氧化活性的米曲霉型豆豉多糖的單因素試驗(yàn)［12］

以對(duì)DPPH自由基清除率為指標(biāo)，分別考察多糖沉淀所用的乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比4個(gè)因素對(duì)米曲霉型豆豉多糖抗氧化能力影響，為正交試驗(yàn)提供有意義的因素及水平。

1.3.3.1乙醇濃度對(duì)米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響

稱取10 g豆豉干粉，加入100 mL蒸餾水，在70℃的恒溫水浴中提取2 h。棄去濾渣，收集上清液，上清液分別以60%、70%、80%、90%的乙醇沉淀，考察不同濃度乙醇沉淀所得的豆豉多糖對(duì)DPPH自由基清除率的影響。

1.3.3.2提取溫度對(duì)米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響

稱取10 g豆豉干粉，加入100 mL蒸餾水，分別在60、70、80、90、100℃的恒溫水浴中提取2 h。過濾，棄去濾渣，收集上清液，上清液用70%乙醇沉淀，沉淀真空干燥。

1.3.3.3提取時(shí)間對(duì)米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響

稱取10 g豆豉干粉，加入100 mL蒸餾水，在80℃的恒溫水浴中分別提取1、2、3、4 h。過濾，棄去濾渣，收集上清液，上清液用70%乙醇沉淀，沉淀真空干燥。

1.3.3.4料液比對(duì)米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響

稱取10 g豆豉干粉，分別加入50、100、150、200 mL蒸餾水，在80℃的恒溫水浴中提取2 h。過濾，棄去濾渣，收集上清液，上清液用70%乙醇沉淀，沉淀真空干燥，以考察不同料液比對(duì)豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響。

1.3.4正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）為三因素，以DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L4（93）進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平表如表1所示。

表1　豆豉多糖提取正交試驗(yàn)因素水平表Table 1Orthogonal experiment factors and levels of douchi polysaccharide extraction

1.3.5多糖含量的測(cè)定方法［13］

采用硫酸-苯酚法測(cè)定。

1.3.6數(shù)據(jù)處理

采用spss16.0、Origin8.0、正交設(shè)計(jì)助手V3.1等軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理分析。

2　結(jié)果與分析

2.1豆豉多糖抗氧化性測(cè)定的單因素試驗(yàn)

2.1.1乙醇濃度對(duì)米曲霉型豆豉多糖DPPH自由基清除率的影響

設(shè)定料液比為1∶10（g/mL），提取溫度為70℃，反應(yīng)時(shí)間為2 h，考察沉淀多糖所用的乙醇濃度（60%、70%、80%、90%）對(duì)豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響。結(jié)果見圖1。

圖1　乙醇濃度對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.1Effect of alcohol concentration in precipitation on DPPH radical scavenging activity

由圖1可見，利用70%的乙醇沉淀得到的多糖對(duì)DPPH自由基的清除率最好，且通過方差分析表明，用60%的乙醇沉淀與70%、80%之間存在顯著差異，70%和80%的乙醇沉淀不存在顯著差異，因此在后續(xù)的試驗(yàn)中采用70%的乙醇進(jìn)行沉淀。

2.1.2提取溫度對(duì)米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響

設(shè)定料液比為1∶10（g/mL），乙醇濃度為70%，反應(yīng)時(shí)間為2 h，考察提取溫度（60、70、80、90、100℃）對(duì)豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響。結(jié)果見圖2。

圖2　提取溫度對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.2Effect of extraction temperature on DPPH radical scavenging activity

由圖2可見，80℃提取的豆豉多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用與其它溫度提取均存在顯著差異，且80℃對(duì)DPPH自由基的清除效果最好。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選用80℃作為正交設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

2.1.3提取時(shí)間對(duì)豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響

設(shè)定料液比為1∶10（g/mL），酒精濃度為70%，反應(yīng)溫度為80℃，研究提取時(shí)間（1、2、3、4 h）對(duì)豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響。結(jié)果見圖3。

圖3　提取時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.3Effect of extraction time on DPPH radical scavenging activity

由圖3可見，2 h提取的豆豉多糖對(duì)DPPH自由基的清除效果最好，經(jīng)方差分析表明，各組均存在顯著差異，因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用2 h為正交設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。2.1.4料液比對(duì)豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響

設(shè)定沉淀多糖乙醇濃度70%，反應(yīng)溫度80℃，提取時(shí)間2 h，研究料液比對(duì)米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響。結(jié)果見圖4。

圖4　料液比對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.4Effect of ratio of material to water on DPPH radical scavenging activity

由圖4可見，料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，豆豉多糖對(duì)DPPH自由基的清除率最高，經(jīng)方差分析表明，各組之間存在顯著差異，因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選用料液比1∶10（g/mL）作為正交設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

2.2豆豉多糖抗氧化性測(cè)定正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

極差的大小反應(yīng)各個(gè)因素對(duì)指標(biāo)影響程度的大小，由表2中的極差值R可以看出，3個(gè)因素中對(duì)米曲霉型豆豉多糖DPPH自由基清除率影響的大小順序?yàn)椋禾崛囟龋玖弦罕龋咎崛r(shí)間。最優(yōu)的提取條件的水平組合為A3B1C2，即提取溫度90℃，提取時(shí)間1 h，料液比1∶10（g/mL）。由極差分析得出的最優(yōu)水平組合并未出現(xiàn)在正交試驗(yàn)組合中，因此進(jìn)行了驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果表明，在最優(yōu)提取條件下，多糖對(duì)DPPH自由基的清除率為64.21%，結(jié)果大于正交表中的最大值。因此A3B1C2為本試驗(yàn)的最優(yōu)組合。

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2The design and results of orthogonal experiment

2.3米曲霉型豆豉粗多糖中的糖含量測(cè)定結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，其回歸方程為Y=17.315X+0.021，R2=0.999 1。最優(yōu)提取工藝所得的粗多糖中糖含量為88.93%（以葡萄糖計(jì)）。

3　結(jié)論

利用熱水浸提法提取米曲霉型豆豉多糖，以抗氧化活性中清除DPPH自由基能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，其最佳工藝條件為：提取溫度90℃，提取時(shí)間1 h，料液比1∶10（g/mL），乙醇沉淀濃度為70%，在此條件下得到的米曲霉型豆豉多糖對(duì)DPPH自由基的清除率64.21%，粗多糖中的糖含量為88.93%（以葡萄糖計(jì)）。

本文的研究可為米曲霉型豆豉多糖的研究提供一定的理論基礎(chǔ)，同時(shí)為保健食品的開發(fā)提供科學(xué)參考，對(duì)于拓寬豆豉的應(yīng)用范圍也有一定的幫助。但本文僅以抗氧化活性中的DPPH自由基的清除活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，而其它的抗氧化活性指標(biāo)有待于進(jìn)一步研究。

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Optimization of Extraction Process of Polysaccharide from Douchi Based on Antioxidant Activity

WU Lan-fang1，2，JIANG Ai-min2，ZHENG Kai-yan1，LIN Min-hao2，HUANG Hong-yuan3，*
（1.College of Pharmacology，Hebei University of Chinese Medicine，Shijiazhuang 050200，Hebei，China；2.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，Guangdong，China；3.Department of Light Industry and Chemical Engineering，Guizhou Light Industry Technical College，Guiyang 550025，Guizhou，China）

DPPH radical scavenging activity as a evaluation index，the extraction process of Aspergillus oryzae douchi polysaccharide was optimized.Using single factor test and orthogonal test to determine the extraction method and the optimum extraction conditions which were that extraction temperature 90℃，extraction time 1 h，ratio of raw material to water 1∶10（g/mL），70%ethanol precipitation.Under this condition，the DPPH radical scavenging activity was 64.21%，and the content of polysaccharide was 88.93%.

Aspergillus oryzae douchi；polysaccharide；extraction process；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.010

河北省教育廳青年基金項(xiàng)目（QN2016187）；河北省大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（201514432025）

吳蘭芳（1985—），女（漢），講師，博士研究生，研究方向：藥食兩用資源開發(fā)與利用。

黃洪媛（1986—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)、微生物。

2015-12-13