海帶多糖酶法降解及其產(chǎn)物生物活性的研究

謝瑾，林宗毅，王智榮，張少敏，崔春，*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510640；2.廣東環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州528216）

海帶多糖酶法降解及其產(chǎn)物生物活性的研究

謝瑾1，林宗毅1，王智榮1，張少敏2，崔春1，*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510640；2.廣東環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州528216）

以酸法提取的海帶多糖為原料，分別用胰酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶及植物水解蛋白酶對(duì)海帶多糖進(jìn)行降解，并測(cè)定了酶解產(chǎn)物的抗氧化性及膽酸鹽吸附率。研究表明，酶解處理顯著提高了其ABTS自由基清除能力和還原力，但降低了海帶粗多糖的膽酸鹽吸附能力和DPPH自由基清除力。其中胰酶和木瓜蛋白酶酶解分別使LPA-C［在液料比30∶1（mL/g），pH2.0，提取時(shí)間3h，溫度120℃條件下提取所得的多糖］的ABTS IC50值由空白樣的1.01 mg/mL，下降為0.80 mg/mL和0.89 mg/mL；還原力A0.5值（還原力吸光值為0.500時(shí)的樣品濃度）從1.61 mg/mL下降到1.51 mg/mL和1.53mg/mL；使LPA-Y［在液料比25∶1（mL/g），pH2.0，提取時(shí)間2h，溫度100℃條件下提取所得的多糖］的ABTSIC50值從3.55mg/mL下降為2.23mg/mL和2.88mg/mL；還原力A0.5值從9.56mg/mL下降到5.50mg/mL和4.69mg/mL。

海帶多糖；檸檬酸提取；酶解；抗氧化性；膽酸鹽吸附能力

海帶是一種具有食用和藥用的大型經(jīng)濟(jì)海藻，生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高，富含維生素、氨基酸、微量元素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素及多糖類物質(zhì)，其含有的多糖成分具有多種生理功能［1］。相關(guān)研究表明，海帶多糖的生物活性功能主要包括免疫調(diào)節(jié)、抗菌抗病毒、抗血凝和降血脂等［2］。海帶中主要有3種多糖，即褐藻膠（algin）、褐藻糖膠（fucoidan）和褐藻淀粉（laminaran），褐藻膠和褐藻糖膠是細(xì)胞壁的填充物質(zhì)，而褐藻淀粉存在于細(xì)胞質(zhì)中。相關(guān)研究表明，褐藻膠是褐藻共有的一種細(xì)胞間多糖，由α-1，4-β古羅糖醛酸（G）和β-1，4-D甘露糖醛酸（L）為單體構(gòu)成的嵌段共聚物；褐藻糖膠是褐藻細(xì)胞壁外層含有的特殊藻膠，是褐藻細(xì)胞分泌產(chǎn)生的黏性物質(zhì)，是α-L巖藻糖4-硫酸酯組成的多聚物；褐藻淀粉，也是一種細(xì)胞內(nèi)多糖，主要由β-1，3-D葡萄糖組成［3］。諸多文獻(xiàn)報(bào)道，植物多糖經(jīng)過(guò)酶法降解后，生理活性顯著提高［4］，如賈俊強(qiáng)等［5］用α-淀粉酶對(duì)蛹蟲(chóng)草多糖進(jìn)行酶解，夏新奎［6］等利用α-淀粉酶對(duì)3種分級(jí)薤白多糖進(jìn)行酶法修飾，最后均發(fā)現(xiàn)，經(jīng)酶法修飾后的多糖的抗氧化活性都得到了顯著地提高。

本試驗(yàn)以兩種檸檬酸法提取海帶粗多糖為原料，分別采用胰酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶及植物水解蛋白酶對(duì)粗多糖進(jìn)行酶法降解，并考察其產(chǎn)物的抗氧化性及膽酸鹽吸附率。本研究可為功能性海帶多糖的開(kāi)發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

海帶：采購(gòu)于廣西北海，清洗后曬干，粉碎過(guò)40目篩，置于干燥器中儲(chǔ)存?zhèn)溆茫粰幟仕帷⑵咸烟恰⑦^(guò)硫酸鉀、三氯乙酸、無(wú)水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、糠醛等（分析純）：廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸（分析純）：江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；Trolox、DPPH、ABTS熒光素鈉鹽（FL）等（分析純：美國(guó)Sigma公司；胰酶（45 000 U/g）：重慶市全新祥盛生物制藥有限公司；果膠酶（35 000 U/g）、纖維素酶（120 000 U/g）：濰坊康地恩生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（500000U/g）：美國(guó)Sigma公司；植物水解蛋白酶（50 000 U/g）：廣州邦銘貿(mào)易有限公司。

酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo公司；DFT200型手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；GT7C2A立式殺菌鍋：溫州市安福防腐機(jī)械廠；pHS-3E型pH計(jì)：北京雷磁儀器公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海生物有限公司；Unico UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼科儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1制備粗海帶多糖

海帶干粉→按液料比30∶1（mL/g）加入檸檬酸溶液（pH=2），溫度120℃，提取3 h→取上清液，用氫氧化鉀調(diào)pH至中性→濃縮→醇沉（乙醇最終濃度為80%）→4℃靜置8 h→取沉淀物→復(fù)溶沉淀物→海帶檸檬酸提多糖溶液LPA-C

海帶干粉→按液料比25∶1（mL/g）加入檸檬酸溶液（pH=2），溫度100℃，提取2 h→取上清液，用氫氧化鉀調(diào)pH至中性→濃縮→醇沉（乙醇最終濃度為80%）→4℃靜置8 h→取沉淀物→復(fù)溶沉淀物→海帶檸檬酸提多糖溶液LPA-Y

1.2.2海帶粗多糖的酶解

參照游麗君等［7］的方法將LPA-Y及LPA-C配置成5 mg/mL的濃度，取50 mL置于錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH至各種酶的最優(yōu)pH［1，8-9］（胰酶pH7.5，果膠酶pH4.2，木瓜蛋白酶pH6.0，植物水解酶蛋白酶pH3.4，纖維素酶pH5.0）。分別加入樣品所含多糖質(zhì)量1%的胰酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶及植物水解蛋白酶及不添加酶（空白）。在50℃中水浴振蕩，水解4 h，在沸水浴中加熱滅酶10 min，冷卻離心（4 800 r/min，20 min）后取上清液即為多糖酶解液樣品。

1.2.3ABTS自由基清除能力測(cè)定

將等量混合ABTS水溶液（14 mmol/L）和過(guò)硫酸鉀K2S2O8水溶液（4.9 mmol/L），在室溫避光條件下靜置12 h～16 h。測(cè)定時(shí)，用50%乙醇溶液將ABTS稀釋，使其在734 nm時(shí)吸光度在0.70±0.02范圍內(nèi)，形成ABTS自由基測(cè)定液。將0.1 mL樣品用ABTS自由基測(cè)定液稀釋至3 mL，準(zhǔn)確振蕩30 s，測(cè)定在30℃下反應(yīng)20 min后在734 nm處的吸光值A(chǔ)i。對(duì)照組A0是以0.1 mL水作同樣處理［10-11］。清除率/%=（1-Ai/A0）×100

1.2.4還原力測(cè)定

將2 mL磷酸鹽緩沖液（pH6.6）和2 mL 1%（g/mL）的鐵氰化鉀溶液混合，再加入2 mL樣品或2 mLTrolox。將混合物在50℃下保溫20 min后加入2 mL 10%（g/mL）的TCA，混合后以3 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL與2 mL蒸餾水以及0.4 mL 0.1%（g/mL）氯化鐵在試管中反應(yīng)，靜置10 min后測(cè)定其在700 nm處的吸光度值［10］。用A0.5（還原力吸光值為0.500時(shí)的樣品濃度）表示還原力大小。

1.2.5膽酸鹽吸附率測(cè)定

參照周小理等［11］的方法，做適當(dāng)修改。準(zhǔn)確配置濃度為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2 mg/mL的膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)液1 mL于具塞試管中，加入6 mL 45%硫酸，混勻，加入1 mL0.3%糠醛，混勻，置65℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min，冷卻至室溫后，于620 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制4 mg/mL牛磺膽酸鈉溶液，加入2 mg/mL的多糖樣品，以蒸餾水作為空白對(duì)照，于37℃恒溫下反應(yīng)1 h后，5 000 r/min離心分離10 min。準(zhǔn)確移取1 mL上清液，進(jìn)行膽酸鹽含量的測(cè)定，于620 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其膽酸鹽的質(zhì)量濃度。再根據(jù)添加多糖樣品及空白溶液中膽酸鹽的濃度差計(jì)算苦蕎水溶性蛋白純化物對(duì)膽酸鹽的吸附量。

1.2.6DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照Blois等［12］的方法，并進(jìn)行一定的修改。配制DPPH自由基的乙醇溶液（0.2 mmol/L，溶于無(wú)水乙醇），并將海帶多糖溶液按一定的梯度稀釋。將2 mL DPPH及2 mL海帶多糖稀釋溶液在試管振蕩混勻，在室溫下避光靜置30 min，在517 nm處測(cè)量其吸光度值A(chǔ)i；用2 mL無(wú)水已醇與2 mL蒸餾水充分震蕩混勻調(diào)零；對(duì)照試驗(yàn)以2 mL DPPH與2 mL無(wú)水乙醇震蕩混勻在測(cè)定波長(zhǎng)517 nm處的吸光度值A(chǔ)c，2 mL海帶多糖溶液和2 mL無(wú)水乙醇震蕩混勻后的吸光值為Aj。海帶多糖對(duì)DPPH自由基清除能力用清除率R表示：R/%=［1－（Ai－Aj）/Ac］×100。IC50值為自由基清除率R達(dá)到50%時(shí)的樣品濃度。

2　結(jié)果與分析

2.1海帶多糖酶解對(duì)ABTS自由基清除能力的影響ABTS自由基清除法被廣泛用于生物樣品的總抗氧化能力測(cè)定。酶解對(duì)LPA-C和LPA-Y的ABTS自

由基清除率的影響見(jiàn)圖1、圖2。

圖1　酶解對(duì)LPA-C的ABTS自由基清除率的影響Fig.1The effect of enzymatic hydrolysis on ABTS radical scavenging activity rate of LPA-C

由圖1和圖2可知，從LPA-C和LPA-Y兩個(gè)的空白樣的IC50值分別為1.01 mg/mL和3.54 mg/mL。胰酶和木瓜蛋白酶顯著降低了LPA-C和LPA-Y的ABTS IC50值，即大幅增強(qiáng)了其ABTS自由基的清除能力。纖維素酶對(duì)LPA-C的ABTS自由基清除能力的提高較對(duì)LPA-Y的明顯，果膠酶和植物水解酶對(duì)LPAY的ABTS自由基清除效果僅略差于胰酶和木瓜蛋白酶，但對(duì)LPA-C的ABTS自由基清除能力并沒(méi)有顯著性的影響。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［13］，用蛋白酶水解多糖，不易破壞多糖的立體結(jié)構(gòu)和生物活性，同時(shí)能使糖蛋白和蛋白聚糖中游離的蛋白質(zhì)水解，可得到純度較高的多糖，有利于提高多糖的抗氧化活性。

圖2　酶解對(duì)LPA-Y的ABTS自由基清除率的影響Fig.2The effect of enzymatic hydrolysis on ABTS radical scavenging activity rate of LPA-Y

2.2海帶多糖酶解對(duì)還原力的影響

抗氧化劑是通過(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基的，還原能力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)，因此可通過(guò)測(cè)定還原能力來(lái)說(shuō)明抗氧化活性的大小［14］。酶解對(duì)LPA-C和LPA-Y的還原力影響見(jiàn)圖3、圖4。

圖3　酶解對(duì)LPA-C的還原力的影響Fig.3The effect of enzymatic hydrolysis on reducing power of LPA-C

圖4　酶解對(duì)LPA-Y的還原力的影響Fig.4The effect of enzymatic hydrolysis on reducing power of LPA-Y

由圖3可知，酶解對(duì)于LPA-C還原力的影響與ABTS自由基清除能力的影響結(jié)果類似，胰酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶對(duì)LPA-C的還原力提高效果遠(yuǎn)高于其他兩種酶，其酶解多糖的A0.5值分別從空白的1.61 mg/mL下降到1.51、1.53 mg/mL和1.54 mg/mL。圖4中可看出，5種酶作用海帶多糖后，其還原力都出現(xiàn)了較為明顯的提升，其中胰酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶的作用效果最為明顯，胰酶樣和木瓜蛋白酶樣A0.5值分別為5.50、4.69 mg/mL，相比空白下降了近一半。因此，結(jié)合ABTS自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果可推測(cè)，pH可能影響了酶解效果，同時(shí)酶自身催化活性及酶解位點(diǎn)不同，也會(huì)使得水解后的多糖分子結(jié)構(gòu)和分子量大小存在差異，表現(xiàn)出不同的抗氧化能力。酸提取后的多糖多為雜多糖，純度不高，即多糖與蛋白質(zhì)或者其他物質(zhì)結(jié)合在一起［15］，經(jīng)蛋白酶、纖維素酶及果膠酶等水解后，能獲得純度較高的低分子多糖，相應(yīng)的抗氧化活性也得到改善。

2.3多糖酶解對(duì)膽酸鹽吸附能力的影響

膽酸鹽吸附率考察的是活性物質(zhì)與腸道內(nèi)膽汁酸結(jié)合形成絡(luò)合物的能力［16］。酶解對(duì)LPA-C和LPA-Y膽鹽吸附率的影響見(jiàn)圖5、圖6。

圖5　酶解對(duì)LPA-C膽酸鹽吸附率的影響Fig.5The effect of enzymatic hydrolysis on cholate adsorption rate of LPA-C

圖6　酶解對(duì)LPA-Y膽酸鹽吸附率的影響Fig.6The effect of enzymatic hydrolysis on cholate adsorption rate of LPA-Y

由圖5可知，LPA-C經(jīng)過(guò)不同酶的酶解處理以后，膽酸鹽吸附率均出現(xiàn)了不同程度的下降，其中木瓜蛋白酶樣和植物水解酶樣下降不明顯，胰酶、果膠酶以及纖維素酶酶解樣品下降明顯。由圖6可知，LPA-Y經(jīng)過(guò)不同酶的酶解處理，纖維素酶水解樣品與空白樣的膽酸鹽吸附率接近，其他4種酶的多糖酶解液膽酸鹽吸附率都出現(xiàn)了明顯的下降，其中胰酶和木瓜蛋白酶的多糖酶解液膽酸鹽吸附率下降了近10%。酶解后多糖膽酸鹽吸附能力下降可能是由于酶的降解作用，使一些本來(lái)容易與膽酸鹽形成絡(luò)合的官能團(tuán)如糖醛酸等減少，也可能是由于酶解過(guò)程中多糖降解改變了多糖的分子量，引起膽酸鹽吸附率的下降。

2.4多糖酶解對(duì)DPPH自由基的影響

酶解對(duì)LPA-C和LPA-Y的DPPH自由基清除能力的影響見(jiàn)圖7、圖8。

圖7　酶解對(duì)LPA-C的DPPH自由基清除能力的影響Fig.7The effect of enzymatic hydrolysis on DPPH radical scavenging activity of LPA-C

圖8　酶解對(duì)LPA-Y的DPPH自由基清除能力的影響Fig.8The effect of enzymatic hydrolysis on DPPH radical scavenging activity of LPA-Y

由圖7、圖8可知，經(jīng)過(guò)酶解處理后，LPA-C和LPA-Y的DPPH自由基清除能力均有不同程度的下降，且變化趨勢(shì)較為相似。LPA-C和LPA-Y的DPPH自由基清除能力經(jīng)胰酶處理后均顯著地下降，其IC50值分別由空白的1.07 mg/mL增加到2.11 mg/mL，由空白樣的5.24 mg/mL增加到6.55mg/mL。對(duì)LPA-Y來(lái)說(shuō)，其他4種酶處理的多糖樣品的DPPH自由基清除能力無(wú)明顯變化。

3　結(jié)論

酶解提高了LPA-C和LPA-Y的ABTS自由基清除能力及其還原力，其中胰酶和木瓜蛋白酶效果最好，使LPA-C的ABTS IC50值由1.01 mg/mL，下降為0.80 mg/mL和0.89 mg/mL，使LPA-Y ABTS IC50值從3.55 mg/mL下降為2.23 mg/mL和2.88 mg/mL，使LPA-C的還原力A0.5值從空白的1.61 mg/mL下降到1.51 mg/mL和1.53 mg/mL，LPA-Y的還原力A0.5值從空白的9.56 mg/mL下降到5.50 mg/mL和4.69 mg/mL。相反地，酶解降低了LPA-C和LPA-Y的膽酸鹽吸附率，其中胰酶和木瓜蛋白酶對(duì)膽酸鹽吸附率的影響較大，同時(shí)也降低了LPA-C和LPA-Y的DPPH自由基清除能力，其中胰酶作用效果最為明顯，其酶解后多糖的分質(zhì)量大小及單糖組成變化還有待進(jìn)一步的研究。

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Enzymatic Hydrolysis of Polysaccharides from Laminaria japonica and Studies on Its Product Activity

XIE Jin1，LIN Zong-yi1，WANG Zhi-rong1，ZHANG Shao-min2，CUI Chun1，*
（1.School of Food Sciences and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China；2.Guangdong Environmental Protection Engineering Vocational College，Guangzhou 528216，Guangdong，China）

The polysaccharides extracted by acid solution from Laminaria japonica were hydrolyzed by trypsin，papain，pectinase，cellulase and plant hydrolysis protease，respectively.The bile salt adsorption capacity and antioxidant activity of hydrolysates were also investigated.The results indicated that after enzymatic hydrolysis，their ABTS radical scavenging ability and reducing power were all improved significantly，while the bile salt adsorption capacity and DPPH radical of the polysaccharide decreased.Trypsin and papain lowered the ABTS IC50value and reducing power A0.5value（the concentration of polysaccharide when the absorbance value of reducing power test was 0.500）of LPA-C（the polysaccharide were extracted from Laminaria japonica under the condition of the 30∶1（mL/g）solvent-material ratio，pH2.0，extraction time 3 h and the Extraction temperature of 120℃）and LPA-Y（the polysaccharide were extracted from Laminaria japonica under the condition of the 25∶1（mL/g）solvent-material ratio，pH2.0，extraction time 2 h and the extraction temperature of 100℃）of LPA-C decreased from 1.01 mg/mL to 0.80 mg/mL and 0.89 mg/mL，and the ABTS IC50value of LPA-Y decreased from 3.55 mg/mL to 2.23 mg/mL and 2.88 mg/mL.The reducing power A0.5value of LPA-C decreased from 1.61 mg/mL to 1.51 mg/mL and 1.53mg/mL，and from 9.56 mg/mL to 5.50 mg/mL and 4.69 mg/mL.

Laminaria japonica polysaccharides；citric acid extraction；enzymatic hydrolysis；antioxidant activities；bile salt adsorption capacity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.007

國(guó)家863項(xiàng)目（2014AA093602）

謝瑾（1991—），女（漢），碩士研究生，從事食品生物技術(shù)方向研究。

崔春（1978—），男，教授，博士，從事食品生物技術(shù)方向研究。

2015-12-15