環介導等溫擴增技術及其在食品檢測中的應用

◎卞 璐，張 旭

（1.遼寧省農業經濟學校，遼寧 錦州 121001；

2.沈陽鐵路局錦州機務段，遼寧 錦州 121001）

環介導等溫擴增技術及其在食品檢測中的應用

◎卞 璐1，張 旭2

（1.遼寧省農業經濟學校，遼寧 錦州 121001；

2.沈陽鐵路局錦州機務段，遼寧 錦州 121001）

環介導等溫擴增技術是一種具有特異性強、操作簡便、快速、高效擴增等優點的等溫核酸擴增方法，可在數十分鐘內完成，通過使用鏈替換核酸聚合酶。基于此，就環介導等溫擴增技術的原理及其在食源性病原微生物的檢測和食品的轉基因成分檢測方面做一綜述。

環介導等溫擴增技術；食品；檢測

環介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是由日本榮研株式會的Notomi T.等首次報道的一種新的核酸擴增方法，不僅能快速擴增DNA，也可實現對RNA的直接擴增[1]。LAMP技術已經在核酸研究、病原微生物的檢測、疾病的診斷和預防、動物的早期胚胎性別鑒定等生命科學領域得到了廣泛應用，并取得了一些成就[2-6]。近年來，該技術也逐步被應用到食品檢測中來。該文就LAMP技術的原理及其在食品檢測即食源性病原微生物的檢測和食品的轉基因成分檢測方面做一綜述。

1　LAMP技術原理

雙鏈DNA在65 ℃左右處于動態平衡狀態，任何一條引物與雙鏈DNA的互補部位進行堿基互補配對延伸的時候，另一條鏈就會脫落變成單鏈，LAMP方法就是利用DNA的這一特點設計而成的。

1.1LAMP技術的引物設計

LAMP方法的4個引物是針對靶基因上的6個區域進行設計的，這6個區域分別是位于3'端的F3c區段，F2c區段、F1c區段和位于5'端的B1區段、B2區段、B3區段（見圖1）。LAMP法的2條內引物FIP（Forward Inner Primer）和BIP（Back Inner Primer），FIP包含有F1c序列、TTTT連接子和F2（F2c的互補序列）；BIP包含有B1c（B1的互補序列）、TTTT連接子和B2序列；2條外引物為F3（F3c的互補序列）和B3序列（B3c的互補序列）（見圖1）[7]。LAMP引物設計除了要避免引物二聚體形成、3′端發夾結構、引物自身互補等原則外，對引物之間的距離也有要求，F3和F2之間，B2和B3之間的距離應該是0～20 bp，引物中形成環的部分距離是40～60 bp，LAMP反應擴增的區域的距離建議是120～180 bp[8]。

圖1　靶序列上6個特異區及引物設計圖

1.2LAMP技術的操作程序

LAMP等溫擴增反應體系通常為25 μ L，包含了模板DNA、引物、Bst DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液。其中內引物濃度為0.8～2.0 μ mol/L，外引物濃度為0.2～0.8 μ mol/L，鎂離子濃度為2～10 mmol/L。各種物質混勻后，置于在60～65 ℃保溫60～90 min，80 ℃滅活10 min，產物于2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，同時用肉眼觀察反應體系的濁度變化[9，10]。

2　LAMP技術在食品檢測領域的應用

目前，LAMP技術在食品檢測領域的應用主要集中在食源性病原微生物的檢測和食品的轉基因成分檢測兩個方面[11-13]。

2.1食源性病原微生物的檢測

LAMP技術在食源性致病菌、食源性病毒[14]及食源性寄生蟲[15]的檢測方面均有研究，但目前報道最多的是食源性致病菌的檢測。董鑫悅等以阪崎腸桿菌的OmpA序列為靶基因，建立了一種檢測乳中阪崎腸桿菌的方法。結果表明，LAMP檢測阪崎腸桿菌純培養物的靈敏度為3.7×101cfu/mL，其靈敏度是PCR方法的10倍，人工污染阪崎腸桿菌滅菌乳的檢測限為4.3×101cfu/mL，具有特異性強、靈敏度高、耗時短的特點[16]。程曉艷等根據副溶血弧菌的毒力基因tdh保守序列設計引物，建立了LAMP快速檢測技術，其細菌DNA最低檢出限為35.5 fg/反應管，并利用該方法對扇貝樣品中致病性副溶血弧菌進行了檢測，證明LAMP技術可用于水產品致病菌的快速檢測，且操作簡單、安全可靠[17]。

2.2食品的轉基因成分檢測

自世界上首例轉基因煙草1983年在美國問世以來[18]，轉基因作物的種類與日俱增，其中轉基因大豆占全球種植面積的51%，玉米占31%，棉花占13%，油菜占5%[19]。而隨著這些轉基因產品大量流入市場，其安全性問題已成為全球爭論的熱點。目前應用的轉基因產品的檢測方法操作步驟煩瑣、檢測成本高、時間長，不適合現場實時監測和跟蹤檢測。LAMP技術作為一種新興的檢測技術，具有操作簡單、無須PCR儀和昂貴的試劑、可快速高效擴增等優點，已逐步應用于食品轉基因成分的檢測分析。我國近年來開展了食品中轉基因成分的LAMP檢測方法的研究。吳少云等針對轉基因水稻Bt63品系外源基因與內源基因結合處序列設計4條特異性引物，建立的實時濁度法LAMP快速檢測技術，能夠特異性檢測轉基因水稻Bt63品系，其最低檢出限為0.01%，是普通PCR方法的10倍[20]。

總之，作為一種新興的檢測技術，LAMP技術既符合食品臨床檢驗所需的要求，也存在著某些不足。隨著LAMP技術的不斷發展和改良，LAMP作為一種新興的檢測技術，必將會憑借其強大的優勢，在基層檢測機構和食品檢測部門得到應用和推廣。而該技術在食品檢測領域的應用和推廣，對于提高食品衛生水平、保證食品安全和推動食品國際貿易發展無疑具有重要的意義。

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Loop-mediated Isothermal Amplification Technololy and Its Application in Food Detection

Bian Lu1， Zhang Xu2
（1.Liaoning Agricultural Economy School， Jinzhou 121001， China；
2. Shenyang Railway Bureau Jinzhou， Jinzhou 121001， China）

Loop-mediated isothermal amplification technology is a kind of isothermal nucleic acid amplification method with strong specificity， simple operation， fast and efficient amplification etc， which can complete in dozens of minutes by using Chain replacement DNA polymerase. In this paper， the principle of loop-mediated isothermal amplification technology and its application in detection of the food borne pathogenic microorganism and geneticallymodifiedingredients in food were reviewed.

Loop-mediated isothermal amplification； Food； Detection

Q817

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.06.014