適體和蛋白質解離常數檢測方法比較分析*

蘇 雪，何逸婷，林俊生

(華僑大學 生物醫學學院，福建 泉州 362021)

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適體和蛋白質解離常數檢測方法比較分析*

蘇 雪，何逸婷，林俊生

(華僑大學 生物醫學學院，福建 泉州 362021)

對基于石英晶體微天平(QCM)生物傳感器的兩種檢測核酸適體與蛋白質解離常數方法進行了比較，提出來一種更加精確合理的檢測流程。以凝血酶和凝血酶適體TBA15為模型，耗散型石英晶體微天平(QCM-D)為傳感器，實時檢測末端修飾巰基適體的固定、表面封閉劑對非特異性結合位點封閉以及兩種不同的蛋白進樣方式引起的頻率響應，實驗數據擬合得到解離常數。不同蛋白的進樣方式得到的解離常數不同，非特異性位點的封閉也同樣影響解離常數的檢測。從低濃度到高濃度依次通入固定體積蛋白的進樣方式，實驗重復性高且消耗樣品量小于1 μg，是較為理想的檢測方式。

石英晶體微天平傳感器； 核酸適體； 蛋白質； 解離常數

0 引 言

石英晶體微天平 (quartz crystal microbalance，QCM) 傳感器是一種以壓電效應為理論基礎的壓電傳感器，能夠實時檢測分子與分子間、分子與細胞間的相互作用，檢測限可達到ng級[1]。由于具備無需標記、靈敏度高、操作簡單等優點[2]，石英晶體微天平傳感器已廣泛應用于材料化學、高分子、分析化學、生物醫學等領域[3],檢測靶標涉及蛋白[4]、小分子[5]、細菌[6]等。

適體是一種新型的功能性分子，經過近30年的發展，由于其特異性和與靶標的親和性可與現在廣泛應用的抗體相媲美，同時具有分子量小、免疫原性低、穩定性高、易于修飾等特點，在傳感器方面的應用[7]已越來越受到人們的關注。適體一般是短鏈的核酸分子或者多肽分子，靶標可為小分子化合物、蛋白質、細胞甚至特異性組織[8]。適體篩選傳統方法是指數富集配體系統進化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技術或其改進技術，篩選完成后往往需要對適體的性能進行表征。親和性是適體優劣評價的關鍵指標之一[9]，不同的表征方法或者相同的方法不同的檢測方案均會造成檢測結果的差異。以蛋白質為靶標的適體分子的親和力檢測中，常用的方法有透析法、硝酸纖維素濾膜法、凝膠電泳法毛細管電泳(capillary electrophoresis,CE)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)等，表面等離子共振、石英晶體微天平、等溫滴定量熱法、熒光強度檢測等，其中表面等離子共振、硝酸纖維素濾膜法、石英晶體微天平三種方法的檢測限均在10-10～10-12mol，但硝酸纖維素濾膜法和表面等離子共振法的重復性較低，穩定性差，實驗過程和制備樣品復雜[10]。石英晶體微天平由于其實驗過程簡單，實驗的重現性高，無需標記且可進行實時監測等優點，正在越來越受到關注[11]。現有的石英晶體微天平傳感器檢測適體和靶標蛋白的親和力的方法中存在兩種檢測方法，一種是使用不同芯片，單次固定核酸適體在芯片上，通入不同濃度固定體積的靶標蛋白[12]；另一種是使用同一芯片，從低濃度到高濃度依次通入固定體積的靶標蛋白[13]。

本文以凝血酶和凝血酶適體TBA15為模型，耗散型石英晶體微天平(quartz crystal microbalance with dissipation，QCM-D)傳感器為表征方法，對現有的石英晶體微天平檢測適體—蛋白的親和性的兩種方法進行了對比。文獻查閱表明，Chen等人[14]和Jane Poloti等人[15]的研究中各使用了其中一種方法，但檢測得到的解離常數相差近一個數量級，存在較大差異，本文就這兩種方法及得到的結果差異進行了探究，提出了一種更加合理，更加精確的檢測方法。

1 方法和材料

如圖1所示，運用石英晶體微天平進行核酸適體和蛋白質接力常數檢測。首先，采用金硫鍵自組裝的方法進行功能化芯片構建，隨后利用封閉劑進行封閉，最后通入靶標蛋白檢測相互作用。

圖1 傳感器檢測流程簡圖Fig 1 Flow chart of sensor detection

1.1 構建核酸適體適體功能化芯片

AT切割的標準芯片(瑞典百歐林),基頻為5 Hz,在使用前用UV表面照射箱照射10 min后，用30 %過氧化氫：濃氨水：水= 2∶2∶10的溶液在75 ℃的條件下進行水浴10 min，用18.0 Ω的超純水冷卻重懸后，氮氣吹干，置于耗散型石英晶體微天平(瑞典百歐林，E4)模塊內，實驗溫度設置為20 ℃，流動泵流速為20 μL/min。設置后，通入超純水穩定系統后，再通入適體與靶標蛋白結合用的緩沖溶液(20 mmol Tris,pH 7.4,140 mmol NaCl,5 mmol KCl,5 mmol MgCl2,1 mmol CaCl2)，檢測系統穩定后，在線通入300 μL(0.5 μmol)緩沖溶液配置的凝血酶特異性適體TBA15(SH—C6—TTT TTT TTT TTT TTT GGT TGG TGT GGT TGG，上海生工)，通入完成后，通入10 min緩沖液去除未結合在芯片表面的適體，實時在線監測適體在芯片表面的固定量。

1.2 抗蛋白非特異性吸附表面構建

由于蛋白質在金芯片表面存在非特異性吸附，因此,需要在適體功能化的芯片表面進行封閉。經過文獻查閱發現，常用的封閉劑為牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)[16]和6—巰基己醇(6—mercapto—1—hexanol,MCH)[17](sigma)。通入濃度為5 μM的BSA和MCH進行芯片表面非特異性結合位點的封閉，QCM-D實時表征封閉劑效果，并對比BSA、MCH和未封閉引起的信號差異。選擇合適的封閉劑，以直接在芯片表面構建封閉劑組裝膜為blank，溶解素(北京索萊寶)為陰性蛋白對照組，Control(SH—C6—ATA CGA GCT TGT TCA ATA CCG ATA GGC GCG TCA GGG AGA CTG AAT CTC TG，上海生工)為陰性適體對照組，buffer組為空白組,對封閉劑的性能進行表征。

1.3 適體與蛋白質解離常數的檢測

運用石英晶體微天平傳感器檢測適體與靶標分子的解離常數，文獻中常用的方法有兩種，一種是使用不同芯片，單次固定核酸適體在芯片上，通入不同濃度固定體積的靶標蛋白，根據濃度依賴曲線計算適體與靶標的平衡力結合常數[18]；另外一種是使用同一芯片，單次固定核酸適體在芯片上，通入不同濃度固定體積的靶標蛋白，根據濃度依賴曲線計算適體與靶標的平衡力結合常數[19]。本文以凝血酶為模型，分別用文獻中已報道的兩種方法進行凝血酶適體TBA15與靶標蛋白質凝血酶的親和力進行檢測，以此比較兩種檢測方法的優劣并對檢測方法進行優化。

2 結果與討論

2.1 核酸適體功能化芯片表征

石英晶體微天平可對適體在芯片表面的固定進行實時監控，如圖1所示。石英晶體微天平是以壓電效應為理論基礎的傳感器，根據Sauerbrey方程可知，其頻率變化與芯片表面的質量變化存在線性關系，芯片表面固定的質量增大，其頻率降低[20]。從圖2中可看出，適體通入后在芯片固定，芯片表面的質量增加，頻率下降，表示適體在芯片表面固定成功；本實驗采用的是最經典的金硫鍵自組裝膜的固定方法，末端—SH修飾的適體可在較短時間內(幾分鐘)在金表面進行固定，構建完成核酸適體功能化的芯片。

圖2 適體固定實時檢測Fig 2 Immobilization of aptamer monitored in real time

2.2 抗蛋白非特異性吸附表面表征

由于適體的進樣量有限，核酸適體功能化的芯片表面仍存在裸露的結合部位，蛋白在這些區域容易進行非特異性的吸附，因此,需要加入封閉劑對這些區域進行封閉處理，本研究中探討了石英晶體微天平中兩種常用的封閉劑MCH、 BSA。本實驗使用的是耗散型的石英晶體微天平，同時可實時監測芯片表面制備的膜的性能變化，芯片表面分子柔性越大，耗散因子增大。如圖3(a)可知，與未封閉組相比，MCH組芯片表面結合的蛋白量比空白組少，但是耗散變化大于空白組，表面芯片表面形成的適體—蛋白的復合物的量大于空白組，反之，可以說明空白組中結合的一部分蛋白與芯片表面發生了非特異性結合。BSA組的效果比MCH組效果差，因此，本文實驗結果表明，MCH是較理想的封閉劑。如圖3(b)可知，buffer組，blank組，control組和溶解素組引起的信號響應明顯低于TBA15實驗組，因此MCH是較理想的封閉劑。

圖3 非特異性位點封閉劑表征Fig 3 Representation of block agent for blocking non-specific binding site

2.3 解離常數的測定

適體與靶標的親和力的表征一般的方法是檢測適配體與靶標的解離常數KD值。利用兩種不同的方法進行解離常數的檢測，如圖4(a)所示,利用第一種方法(binding assay 1)，頻率的變化隨著蛋白濃度的變化而增大。但由于在檢測過程中使用了不同的芯片,適體在芯片上的狀態存在差異，如圖4(c)所示，3次獨立重復實驗的誤差較大。利用第二種方法(binding assay 2)，由圖4(b)所示，在同一核酸適體功能化的芯片表面依次通入不同濃度等體積的凝血酶蛋白，頻率依次下降。隨著濃度的增大，頻率下降的幅度先減后增。由于在同一功能化的芯片表面進行，如圖4(d)所示，在實驗過程中的3次獨立重復實驗誤差較小。此外。就實驗次數和樣品用量而言，第一種方法檢測，需要進行的實驗次數是15次，而第二方法檢測需要的實驗次數為 3次，大大縮短了實驗時間。由于靶標分子為凝血酶蛋白，適體與蛋白的結合與其酶活有一定的關系，第一種檢測方案中，每次需要使用新配置的蛋白，蛋白消耗量大，第二種方案需要使用的蛋白量小于1 μg。運用軟件GraphPad Prism進行數據擬合結果發現，第一種方案檢測得到的KD值為119 nmol,第二種檢測方案得到的KD值為43.24 nmol。因此，這兩種檢測方法得到的KD值差異較大。

圖4 解離常數檢測Fig 4 Detecion of dissociated constant

2.4 分析與討論

凝血酶與TBA15的親和力檢測使用的方法很多，KD值為2～170 nmol不等[21]，結果差異較大。本文以石英微天平傳感器為表征方法，檢測后得到的解離常數分別為119,43.24 nmol。前者檢測方法與2010年Chen等人利用石英晶體微天平表征方法相同，但比其得到的解離常數(159±30) nmol小，差異在于本研究使用的是將適體固定在芯片表面后進行非特異性位點的封閉，Chen的研究使用的是混合固定方法，封閉劑使用的是MCH,易揮發，因此，適體在芯片上固定量存在較大差異，導致解離常數較大。后者與Jane Poloti[15]檢測結果存在差異，比其檢測得到的(17.7±0.3) nmol大。對比實驗過程，Jane Poloti在實驗中沒有進行非特異性位點封閉，因此,在適體功能化芯片上蛋白的結合量大于進行了非特異性位點封閉結果，導致其解離常數變小。本實驗中，將適體固定的在線定量檢測和高度精確的非特異性位點封閉方法結合，進行TBA15和凝血酶的解離常數檢測，得到了一個較合理的解離常數，實驗結果重現性高，實驗時間短，能夠迅速準確地得到精度較高的檢測結果。

3 結 論

綜上所述，QCM生物傳感器檢測核酸適體與蛋白質解離常數方法可因蛋白進樣方式，封閉劑種類及封閉劑使用發生而存在差異，可能的原因是適體與蛋白在芯片表面形成的復合物和封閉劑與適體在芯片表面的分布由于空間位阻對蛋白的結合有影響。該研究可為基于石英晶體微天平檢測適體與蛋白質靶標或者其他分子靶標檢測方法的建立提供較有力的證據。

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林俊生,通訊作者，E—mail junshenglin@hqu.edu.com。

Comparative analysis of detection methods for dissociation constant of aptamer and protein*

SU Xue,HE Yi-ting,LIN Jun-sheng

(School of Biomedical Science,Huaqiao University,Quanzhou 362021,China)

Compare the two detection methods of dissociated constant of aptamer and protein based on quartz crystal microbalance(QCM)biosensor,a protocol with high accuracy and reasonability is introduced. Thrombin and thrombin aptamer named TBA15 are used as models.The immobilization of thiolated aptamer,the block of the non-specific site and the signal response induced by two different sampling methods are monitored by QCM with dissipation(QCM-D)biosensor in real time and dissociated constant are calculated by data fitting.Dissociated constant are different when different sampling methods are used,and different block agent applied,blocking of nonspecific site.The sampling method with fixed bulk of protein from low concentration to high concentration are proved ideal method with high repeatability and fewer regents needed which is less than 1 μg.

quartz crystal microbalance(QCM)sensor;aptamer;protein;dissociated constant

10.13873/J.1000—9787(2016)11—0047—04

2016—10—14

國家自然科學基金資助項目(81270734)； 華僑大學高層次人才項目(13Y0391)

Q 31

A

1000—9787(2016)11—0047—04

蘇 雪(1991-)，女，江西撫州人，碩士研究生，研究方向為適體與靶標結合表征。