擬南芥P35S：HA—IQM2表達載體的構建與鑒定

程靜之　張藝能　周玉萍　黃小玲　田長恩

【摘 要】擬南芥AT3G13600編碼的IQM2含有1個IQ基序，是一個鈣調素結合蛋白；其突變體表現為遲花表型，是研究鈣調素信號參與成花調控的新材料；其C-端與天花粉素同源，可能具有RNA結合活性。為了進一步獲得IQM2參與成花調控的證據、研究植物體中與之結合的蛋白及其RNA結合活性，擬構建P35S：HA-IQM2植物表達載體?？寺～@得IQM2 cds，利用SalI和SacI過渡到pMD19-SmaI-P35S-HA- SalI-SacI載體上，再利用SmaI和SacI將獲得的pMD19-SmaI-P35S-HA-IQM2-SacI載體定向克隆至表達載體pBIH1上，通過PCR和酶切鑒定，證明P35S-HA-IQM2表達載體已構建成功。

【關鍵詞】IQM2擬南芥；P35S：HA-IQM2；表達載體

鈣調素信號（Calmoduolin，CaM）是高等植物的一類非常重要的信號，參與多種細胞生理和生長發育調節。田長恩和周玉萍[1]對植物含IQ基序的鈣調素結合蛋白（calmodulin-binding protein，CaMBP）的類型及其功能特點等進行了全面的綜述。擬南芥IQM家族有六個成員，即IQM1到IQM6，均只含有1個能與鈣調素結合的IQ基序（氨基酸序列為IQXXXRGXXXR），N-端與豌豆重金屬誘導蛋白6A（Pea Heavy-Mmetal Induced Protein 6A，PHMIP 6A）同源，C-端與天花粉素（Trichosantin）同源，可能具有RNA結合活性[2-3]。其中，IQM2由At3g13600編碼[2]。實驗證明，IQM2在植物和酵母細胞中都能與CaM5結合，因此是1個鈣調素結合蛋白[4-5]。實驗室對IQM2進行了生物信息學分析，并克隆得到其cDNA序列[6]，還發現其突變體在長日照條件下呈現遲花表型，暗示IQM2參與成花調控[3]，是研究鈣調素信號調控成花的新材料。本文構建P35S：HA-IQM2表達載體，旨在進一步獲得IQM2參與成花調控的證據、研究植物體中與之結合的蛋白及其RNA結合活性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種和質粒：農桿菌菌株由中國農業大學葉德教授惠贈；質粒T-Vector pMD19（Simple）購于TAKARA公司，pBIH1、pMD18-IQM2、pUC19-35S-HA-ARF8由本實驗室保藏。試劑盒和工具酶：質粒提取、DNA純化、膠純化試劑盒和限制性核酸內切酶均購自TAKARA公司?；瘜W試劑及其他：硫酸鏈霉素、氨芐青霉素鈉、氯化鈉、蛋白胨、瓊脂粉、蔗糖、酵母提取物等購自生工公司；MS（Murashige & Skoog）salts、潮霉素等購自Sigma公司。測序：由華大基因公司完成。引物合成：由TAKARA公司完成。

1.2 實驗方法

質粒提取和DNA片段回收：按照相應試劑盒提供的步驟進行。PCR反應體系及循環參數設置：按照鄭景生和呂蓓[7]提供的方法進行。T-A克?。?.5μL目的片段+ 0.5μLT-Vector pMD19（Simple）+ 5μLSolution I，16℃連接過夜。大腸桿菌轉化：按黃永蓮和黃真池[8]提供的熱激轉化法進行。轉化子的篩選鑒定：采用菌落PCR篩選陽性轉化子，并外送公司測序。

2 結果與分析

以pMD18-IQM2、pUC19-35S-HA-ARF8為模板，分別用SalI-IQM2-F和SacI-IQM2-R、SmaI-P35S-F和HA-R引物組合對其進行PCR擴增，回收產物，進行TA克隆，轉化大腸桿菌，轉化菌落經PCR篩選獲得陽性轉化子pMD19- SalI-IQM2-SacI（圖1A，約1.8kb）和pMD19-SmaI-P35S-HA-SalI-SacI（圖1B，約0.85kb），送華大基因公司測序。

分別用SalI和SacI對測序證實無突變的載體pMD19-SalI-IQM2 cds-SacI和pMD19-SmaI-P35S-HA-SalI-SacI進行雙酶切，后者得到具有相應酶切位點的線性化載體，前者割膠回收約1.8kb的IQM2 cds，再將二者連接，轉化大腸桿菌，經菌落PCR篩選獲得陽性轉化子pMD19-SmaI-P35S-HA-IQM2-SacI。

分別用SmaI和SacI對中間載體pMD19-SmaI-P35S-HA-IQM2 cds-SacI和表達載體pBIH1進行雙酶切，前者獲得約2.6kb的目的片段，后者獲得約14kb的線性化載體，分別大體系割膠回收，連接并轉化大腸桿菌，經菌落PCR篩選獲得陽性轉化子P35S：HA-IQM2。

將相應的轉化子提取質粒，并進行PCR和酶切鑒定（圖2）。在圖2中，A和B分別為P35S-HA和IQM2 cds的擴增片段，得到約0.85kb和1.8kb的特異性條帶；C為質粒SmaI和SacI雙酶切的結果，得到約14kb的載體片段和約2.6kb的P35S-HA-IQM2 cds目的片段。結果表明，P35S-HA-IQM2植物表達載體已構建成功。

3 討論

課題組發現IQM2含有1個IQ基序，是1個鈣調素結合蛋白[2，4-5]；其突變體具有晚花表型，說明其涉及成花調控[3]；其C-端與天花粉素同源，可能具有RNA結合活性[2-3]。不過，與IQM2結合的鈣調素還不清楚；IQM2參與成花調控的證據還有待補充；其RNA結合活性尚未明確。因此，有必要構建P35S：HA-IQM2表達載體。本研究成功構建了該載體，在轉化IQM2突變體植株，篩選獲得轉基因純合子植株后，可通過表型觀察，分析IQM2參與成花調控的功能；可利用HA標簽釣取與IQM2結合的蛋白；還可利用RNA免疫共沉淀，分析IQM2的RNA結合與降解活性。

【參考文獻】

[1]田長恩，周玉萍.植物具IQ基序的鈣調素結合蛋白的研究進展[J].植物學報，2013，48：447-460.

[2]Zhou YP， Chen YZ， Yamamoto KT， Duan J， Tian CE. Sequence and expression analysis of the Arabidopsis IQM family[J].Acta Physiol Plant，2010，32：191-198.

[3]張藝能.擬南芥IQM2參與開花調控的功能研究[D].廣州：廣州大學，2014.

[4]陳羽中.擬南芥IQM2基因功能的初步研究[D].廣州：華南農業大學，2010.

[5]王龍濤.擬南芥IQM2基因功能的研究[D].廣州：華南農業大學，2012.

[6]陳羽中，周玉萍，蕙，桂林，郭培國，田長恩.擬南芥IQM2 cDNA的克隆與生物信息學分析[J].武漢植物學研究，2010，28：353-358.

[7]鄭景生，呂蓓.PCR 技術及實用方法[J].分子植物育種，2003，1（3）：381-394.

[8]黃永蓮，黃真池.大腸桿菌感受態細胞的少量制備方法及轉化條件研究[J].安徽農業科學，2008，36（11）：4450-4451.

[責任編輯：王偉平]