用血球計數板觀察酵母菌種群密度實驗要點解析

郭晴嵐

摘 要 就血球計數板的規格、操作要點、計算方法以及血球計數板的優缺點做了簡單的闡述，基本覆蓋了高中生物必修3中“觀察酵母菌種群數量變化”的實驗操作時學生容易出現的失誤和學生容易忽略的問題。

關鍵詞 血球計數板 操作 酵母菌 菌液密度

中圖分類號 G633.91 文獻標志碼 B

血球計數板是一種對人體紅細胞、白細胞進行顯微計數的工具，也常應用于觀察計算一些體積略大的，呈分散分布的單細胞微生物的數量，它是一種常見的生物學器具。人民教育出版社出版的高中生物教材《必修3·環境與穩態》中，在探究酵母菌種群密度的實驗里，明確要求應用血球計數板來觀察酵母菌種群數量的變化，并要求學生在此基礎上能夠建構酵母菌種群數量增長的數學模型。所以，如何正確操作血球計數板并通過計算得到酵母菌種群的數量就成為這個探究實驗成功的基礎。

1 血球計數板的簡介（XB.K.25型）

XB.K.25型血球計數板是由厚玻璃制成的，在正面由H形的凹槽將血球計數板分隔為上下兩個同樣的計數池。計數池兩側各有一支持柱，將血球計數板蓋玻片（簡稱血蓋片）覆蓋其上，形成上下兩個高為0.10 mm的計數池。每個計數池內均畫有9個大方格，每個圖中，中央大方格被雙線分成25個中方格（位于正中及四角的5個中方格是血球計數板的計數區域），每個中方格用單線劃分為16個小方格。至此，每個計數池中的中央大方格都包含400個小方格（圖1）。

2 血球計數板的操作

我國現行的高中生物學教材中多沒有很詳細的血球計數板的操作過程介紹。如果沒有教師的相應指導，學生很容易因為操作不當而導致失敗。以下從容易失誤的幾個方面加以說明：

（1） 鏡檢計數室。因前一次清洗不到位，或者保存過程中存在污染，更或者因操作不當導致的計數室存在劃痕，若不及時清洗或更換，則會對后期實驗計數產生極大影響。所以，在每次使用血球計數板之前都需要加一步鏡檢計數室，如若在鏡檢時發現計數室有污物，則需按要求清洗并吹干后再進行實驗。

（2） 搖勻后取液。未搖勻的情況下，酵母菌因比重較大都沉降在培養液的下方，若此時取液，會導致計數得到的酵母菌數量存在偏差。

（3） 先蓋血蓋片后加菌液。在菌懸液搖勻后，應先在血球計數板上蓋上血蓋片，再用滴管吸取少許菌懸液，從計數區中間平臺沿血蓋片的上邊緣滴入一小滴菌懸液，利用液體的表面張力一次性充滿計數區。若先加菌液再覆蓋血蓋片，則容易因為菌液加入過多，而導致血蓋片未與血球計數板支持柱接觸，血蓋片浮于菌液上方而導致最后計數偏大，同時會因為有氣泡產生而導致計數偏小。這個易錯點不僅操作上經常出現，而且高考中也曾有所涉及，如2009年福建省的高考選擇題中的一選項是“對酵母菌計數時，用吸管吸取培養液滴滿血球計數板的計數室及其四周邊緣，輕輕蓋上蓋玻片后即可鏡檢”。

（4） 靜置片刻再計數。靜置5 min，待菌懸液不再漂浮流動，酵母菌全部沉降后再將血球計數板放到顯微鏡下進行計數。先在低倍鏡下找到需要觀察計數的大方格及中方格，將中方格移到視野中央，然后撥動轉換器移至高倍鏡進行計數。

（5） 高倍鏡下調亮度。低倍鏡下，用平面鏡和小光圈，可以清晰地看到血球計數板上的酵母菌。但是，撥動轉換器換到高倍鏡后，即使是用了平面鏡和最小光圈，視野里往往還是白茫茫一片，什么都看不見，這時候可以嘗試操作遮光器上的金屬遮光片進行遮光處理。因為活的酵母菌和培養液的折光率相近，所以要在高倍鏡下將視野調得暗一些。

（6） 掌握計數原則。在高倍鏡下進行酵母菌的計數，對于壓在方格界線上的酵母菌應當計數同側的相鄰兩邊上的菌體數，一般可采取“計上不計下，計左不計右，計上左兩邊的一個夾角”的原則處理，另兩條邊和三個角不計數。一般選擇觀察的菌液濃度控制在每個小方格內有4或5個酵母菌為宜，若酵母菌濃度太高，可適當稀釋。若遇到酵母菌出芽生殖的情況，觀察芽體，若芽體達到母細胞大小的一半時，即可作為2個菌體計數。計數一個樣品要從一塊血球計數板的2個計數室中計得的平均值來計算，對每個樣品可計數3次（每次數值不應相差過大，否則應重新操作），再取其平均值，由此來得出血球計數板上酵母菌的估算數量，從而進行種群密度的計算。

（7） 清洗血球計數板。血球計數板上有網格，所以切忌用刷子對其進行刷洗，應用流水沖洗，自然晾干或者吹風機吹干或者使用有機溶劑脫水使其干燥，并鏡檢合格后再放入配套的保存盒。

近年在高考或學業水平測試中，也時有涉及上述內容的試題出現。

3 利用血球計數板對酵母菌菌液密度的計算（XB.K.25型）

依據從5個中方格中計數得到的酵母菌數（計數需重復至少3次，取平均值），利用酵母菌（個數/mL）=5個中方格細胞總計數/5×25×10 000×稀釋倍數 即可得到酵母菌菌液的密度。學生通過血球計數板的操作和計算，進一步增強了對生物學問題的理解，從而達到理論聯系實際，并解決實際問題的要求，這方面的要求在近年的高考中也有體現，如：

2012年江蘇省高考第27題：（2）③將樣液稀釋100倍，采用血球計數板（規格為1 mm × 1 mm × 0.1 mm）計數，觀察到的計數室中細胞分布圖（圖2），則培養液中藻細胞的密度是 個/mL。（答案：108）

解析：因血球計數板規格為1 mm × 1 mm × 0.1 mm，所以應取四角和最中間5個中方格計數，依據計上不計下，計左不計右的原則處理，5個中方格內共有5+4+4+4+3=20個酵母菌，平均每個中方格內有4個酵母菌。計數區25個中方格，所以一共有4×25=100個酵母菌。計數區體積為1mm × 1mm × 0.1mm=0.1mm3=0.1×10-3mL，換算成1mL則有酵母菌100×104個，再乘以稀釋倍數100，結果為108個/mL。

4 運用血球計數板計數的優勢與局限

用血球計數板進行酵母菌種群數量的計數，其優點是顯而易見的，如操作相對比較簡單，耗時短，成本低，可重復性強。但缺點也很明顯，利用血球計數板進行計數時，視野范圍內無法區分細胞的死活，所以計數時，死的和活的細胞都計數在內，數值存在誤差；對于一些體積較小的微生物，用血球計數板在高倍鏡下也很難觀察到，通常就需要選用價格更昂貴的細菌計數板或者使用油鏡；血球計數板不適合用以觀察和計數如放線菌等絲狀微生物，也不能用于鏈狀或不分散的微生物的觀察等。