HPLC測定馬黛茶中咖啡因和可可堿含量

陳靜，胡海峰

(中國醫藥工業研究總院 國藥集團健康產業研究院有限公司，上海 200040)

HPLC測定馬黛茶中咖啡因和可可堿含量

陳靜，胡海峰*

(中國醫藥工業研究總院 國藥集團健康產業研究院有限公司，上海 200040)

目的建立了同時測定馬黛茶生物堿(可可堿和咖啡因)含量的高效液相色譜法。方法采用華譜Unitary C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇和0.5%甲酸水溶液為流動相，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為280 nm。結果馬黛茶中可可堿和咖啡因在5.010～200.0 μg·mL-1呈現良好線性關系，r均大于0.999，RSD均小于1.70%，平均回收率分別為96.59%和97.20%。結論該方法簡便、準確、靈敏、重復性好，可用于馬黛茶的質量控制。

馬黛茶；生物堿；可可堿；咖啡因；HPLC

馬黛Ilexparaguaynensis生長于南美叢林，是冬青科大葉冬青近似的一種多年生木本植物，樹上嫩葉經人工采摘、烘焙，就制成了南美人常飲用的巴拉圭茶，俗稱馬黛茶，與咖啡、茶(紅茶、綠茶等)并稱為“世界三大茶”[1]。馬黛茶富含196種活性元素，長期飲用可改善人體內環境，提升血液品質，全面保持機體營養平衡，是迄今為止人類發現的能實現雙向生理調節作用的少數幾種單科植物之一[2-3]。除了馬黛多酚，生物堿也是馬黛茶的主要活性成分，含量最多的是咖啡因和可可堿[4]。目前國內對馬黛茶生物堿的分析及定量研究均未見報道。本研究建立HPLC定量分析馬黛茶中2種生物堿的方法，有助于完善馬黛茶的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 1525二元泵，2707自動進樣器，2998DAD檢測器，Breeze色譜工作站；BUCHI R-200旋轉蒸發儀 (瑞士Buchi公司)；粉碎機(XL-400B型)；分析天平(METTLER TOLEDO AG135)；eppendorf Research plus(100 μL、200 μL、1 mL)。

1.2 試藥

對照品：可可堿(上海詩丹德生物技術有限公司，批號：1056/15687，含量≥98.0%)；咖啡因(上海詩丹德生物技術有限公司，批號：1392/15686，含量≥98.0%)；青色和黃色馬黛茶(巴西BARAO馬黛茶)；甲醇為色譜級，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為華譜Unitary C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為0.5%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)；采用梯度洗脫(0～10 min，90%A，10%B；10～30 min，50%A，50%B)；流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為280 nm；柱溫為室溫；進樣量為10 μL；分離度大于1.5；理論塔板數按可可堿峰和咖啡因峰計算不低于5000。HPLC圖見圖1。

注：A.混合對照品；B.提取物樣品；1.可可堿；2.咖啡因。圖1 馬黛茶提取物及混合對照品HPLC圖

2.2 混合對照品溶液的制備

2.2.1 可可堿對照品的制備 由于可可堿在水中的溶解度較小，需要在熱水中溶解。精密稱定可可堿對照品10.00 mg，加水溶解并定容到25 mL容量瓶中制成對照品貯備液。使用時根據需要用水稀釋至相應的濃度。

2.2.2 咖啡因對照品的制備 精密稱定咖啡因對照品10.00 mg，加水溶解并定容到10 mL容量瓶中制成對照品貯備液。使用時根據需要用水稀釋至相應的濃度。

2.2.3 可可堿和咖啡因混合對照品溶液制備 分別取可可堿、咖啡因對照品貯備液250、100 μL，將其混合液定容至1 mL，配制成混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備[5]

將青色馬黛茶粉碎，過32目篩備用，稱取青色馬黛茶3.00 g，加入60 mL娃哈哈純凈水，在80 ℃下回流提取1.0 h，趁熱過4層紗布，定容至50 mL的容量瓶中，經0.22 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液。

2.4 線性關系考察

精密稱取可可堿對照品適量，加水制成每1 mL含可可堿0.400 mg的溶液，即得。精密稱取咖啡因對照品適量，加水制成每1 mL含咖啡因1.000 mg的溶液，即得。將上述可可堿和咖啡因對照品分別依次稀釋，制成一系列濃度的對照品溶液，進行測定。以對照品的質量濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，分別繪制標準曲線，計算回歸方程，結果可可堿在5.010～200.0 g·mL-1、咖啡因在5.010～200.0 g·mL-1線性關系良好，符合外標法定量測定的要求。可可堿回歸方程：Y=36 123X-66 922(r=0.999 1)。咖啡因回歸方程：Y=21 852X-13 916(r=0.999 8)。

2.5 精密度試驗

精密吸取同一份供試品溶液(批號：20150208)，按2.1色譜條件下重復進樣6次，記錄可可堿和咖啡因的峰面積，結果可可堿和咖啡因峰面積的RSD分別為0.70%、0.61%，結果表明，所用儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一供試品(批號：20150208)，分別于0、2、4、6、8、19、24 h，按2.1色譜條件進樣測定，考察其穩定性，結果可可堿和咖啡因峰面積的RSD分別為0.38%、0.90%，結果表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.7 重復性試驗

取同一批樣品(20150208)6份，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件進樣測定，記錄峰面積，結果可可堿和咖啡因峰面積的RSD分別為1.34%、1.65%。結果表明，該方法重復性良好。

2.8 回收率試驗

稱取已知含量的樣品(批號：20150208，可可堿質量分數為0.020%，咖啡因質量分數為0.13%)樣品6份，每份約2.0 g，精密稱定，分別加入一定量的可可堿和咖啡因對照品溶液，按照2.3方法制備供試品溶液，按照2.1方法進樣測定，計算回收率，結果見表1。

表1 馬黛茶中可可堿和咖啡因回收率測定

2.9 樣品測定

各種馬黛茶葉樣品按2.3方法平行制備3份樣品溶液，在2.1色譜條件下進樣分析，計算結果見表2。

表2 不同馬黛茶產品中生物堿含量測定(n=3) /mg·g-1

注：總生物堿的質量分數為可可堿、咖啡因的質量分數之和。

3 討論

3.1 流動相的選擇

本實驗最初選擇等度洗脫，流動相比例為甲醇-水(15∶85)，在該條件下進樣，發現可可堿和咖啡因對照品液相圖譜存在拖尾現象。為了解決拖尾現象，可在流動相中添加酸[6-7]，如：磷酸、甲酸、乙酸。由于磷酸的酸性較強，容易損壞儀器和柱子，因此選用甲酸。流動相選為甲醇-0.5%甲酸溶液，實驗結果表明，加入甲酸后，可可堿和咖啡因對照品液相圖譜中峰的拖尾現象明顯減少。

3.2 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器對2種生物堿對照品進行波長掃描，可可堿和咖啡因最大波長均在272 nm，其280 nm處生物堿的吸收與270 nm處無明顯差異，通過對比有關馬黛茶生物堿參考文獻中可可堿和咖啡因的含量測定方法，檢測波長定為280 nm[8-9]。

3.3 梯度條件的優化

由于馬黛茶水提物中存在多種物質，等度洗脫無法將樣品中的各種物質很好地分離，因此本實驗進行了多種梯度洗脫條件研究，最終確定以下洗脫程序：0～10 min，甲醇為10%；10～30 min，甲醇為50%。在此梯度條件下，可可堿和咖啡因均能得到較好的分離，峰形良好，保留時間穩定。

實驗建立的分析方法簡便、準確、分離度與穩定性好，可作為馬黛茶的質量控制方法。

[1] 趙琪，臧曉韻，胡海峰.馬黛茶多酚的加壓毛細管電色譜法的定量分析[J].食品與發酵工業，2015，41(1):234-238.

[2] Márquez V，Martínez N，Guerra M，et al.Characterization of aroma-impact compounds in yerba mate (Ilex paraguariensis) using GC-olfactometry and GC-MS[J].Food Research International，2013，53(2)：808-815.

[3] 于少泓，吳俊玲，劉昭純.馬黛茶臨床作用研究進展[J].山東中醫藥大學學報，2010，34(4)：370-372.

[4] 吳俊玲，高紅莉，劉昭純.馬黛茶及有效成分研究概況[J].山東中醫雜志，2010，29(9)：650-652.

[5] 王忠華，史姍姍，陳雨，等.浙貝母生物堿提取工藝研究[J].中藥材，2010，33(1)：128-132.

[6] 宋玉國，張新茹，李秀芬，等.HPLC測定清咳平喘顆粒中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量[J].中國現代中藥，2014，16(4)：319-322.

[7] 劉軍鋒，邵萌，李景源，等.RP-HPLC測定苦木生物堿體外對磷酸二酯酶4的抑制活性[J].中國現代中藥，2009，11(3)：30-33.

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DeterminationofCaffeineandTheobromineinMateTea(Ilexparaguariensis)byHPLC

CHENGJing，HUHaifeng*

(SinopharmHealthIndustryInstituteCo，Ltd，ChinaStateInstituteofPharmaceuticalIndustry，Shanghai200040,China)

Objective：An HPLC method was established for simultaneous determination of theobromine and caffeine—two bioactive compounds from Mate Tea (Ilexparaguariensis).MethodsAn Unitary C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)column was used with the mobile phase of methanol and water containing 0.5% of formic acid at the detection wave length of 280 nm and the flow rate of 1.0 mL·min-1.ResultsThe two alkaloids were successfully separated in 30min，and the calibration curves of theobromine and caffeine were linear in the range of 5.010-200.0 μg·mL-1with correlation coefficient of 0.999.The recovery rates were 96.59% and 97.20%，respectively with RSD less than 1.70%.ConclusionThe established method is simple，accurate，sensitive and good repeatability，which can be applied for the quality control of Mate Tea (I.paraguariensis).

Mate Tea (Ilexparaguarienses)；alkaloids；theobromine；caffeine；HPLC

2015-04-13)

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胡海峰，研究員，博士生導師，研究方向：微生物藥物研究與開發；E-mail：haifenghu88@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.011