UVB誘導HaCaT分泌細胞因子對HSF的影響及桃葉珊瑚苷的保護作用△

陳巧云，王業(yè)秋，祁永華，李建民，張寧

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 佳木斯 154007)

UVB誘導HaCaT分泌細胞因子對HSF的影響及桃葉珊瑚苷的保護作用△

陳巧云，王業(yè)秋，祁永華，李建民*，張寧

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 佳木斯 154007)

目的探討紫外線B波(UVB)誘導HaCaT分泌細胞因子通過旁分泌機制對HSF的影響及桃葉珊瑚苷的保護作用。方法將桃葉珊瑚苷作用于正常及光老化HaCaT細胞，ELISA試劑盒檢測IL-6、TNF-α含量，并將各組培養(yǎng)液分別作用于HSF細胞，RT-PCR、Western-Blot檢測HSF細胞中MMP-1、MMP-3的mRNA及蛋白表達。結果桃葉珊瑚苷對正常HaCaT細胞分泌IL-6和TNF-α沒有顯著影響，而對光老化HaCaT分泌IL-6和TNF-α具有顯著的抑制作用(P<0.01)，光老化HaCaT培養(yǎng)液使HSF中MMP-1、MMP-3的mRNA和蛋白表達量升高，桃葉珊瑚苷處理組能夠明顯改善這種作用(P<0.01)。結論桃葉珊瑚苷通過減少炎癥細胞因子IL-6、TNF-α分泌來拮抗UV對角質(zhì)形成細胞的損傷，又可通過抑制旁分泌機制，保護成纖維細胞，抑制MMP-1、MMP-3的過表達，預防光老化。

桃葉珊瑚苷；HaCaT細胞；HSF細胞；光老化

紫外線B波(UVB)誘導表皮角質(zhì)形成細胞分泌IL-6、TNF-α等細胞因子通過旁分泌機制促進真皮成纖維細胞表達MMPs，引起光老化[1-2]。本課題組前期研究結果發(fā)現(xiàn)，1×10-5mol·L-1的桃葉珊瑚苷(aucubin，AU)通過調(diào)節(jié)IL-6和TNF-α的表達，拮抗UVB對角質(zhì)形成細胞的損傷，筆者研究桃葉珊瑚苷干預下的光老化角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)液上清對成纖維細胞分泌MMPs的影響，進一步解釋桃葉珊瑚苷抗光老化的作用機理。

1 材料與儀器

1.1 材料

人皮膚成纖維細胞HSF(上海艾研生物科技有限公司)，角質(zhì)形成細胞HaCaT(上海中橋新舟生物科技有限公司)，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液(Thermo Fisher公司)，桃葉珊瑚苷(成都曼思特生物科技有限公司)，PCR擴增試劑盒、第一鏈cDNA合成試劑盒、目的基因及內(nèi)參引物[生工生物工程(上海)有限公司]，人腫瘤壞死因子-α試劑盒、人白介素-6試劑盒(上海晶美生物科技有限公司)，目的蛋白一抗MMP-1、MMP-3、內(nèi)參β-actin、二抗(Santa Cruz Biotechnology)。

1.2 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱HF90型(上海智城分析儀器有限公司)，紫外線輻照計(北京師范大學光電儀器廠)，紫外線光療儀SS-01B型(Sigma公司)，PCR擴增儀Tprofessional型(德國biometra公司)，電泳儀DYY-10C型(北京市六一儀器廠)，凝膠成像系統(tǒng)ChampGel 5000型、一體式微型化學發(fā)光成像儀smart chemill型(北京賽智創(chuàng)業(yè)有限公司)。

2 方法

2.1 細胞的體外培養(yǎng)

HSF細胞、HaCaT細胞均在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，37 ℃，5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。

2.2 分組

2.2.1 HaCaT細胞分組 指數(shù)生長期的HaCaT細胞，以每孔1×106個接種于6孔板，隨機分為正常對照組：細胞培養(yǎng)24 h后，換不含藥DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；UV照射組：細胞培養(yǎng)24 h后參考文獻[3]方法以64 mJ·cm-2的UVB照射建立細胞光老化模型，添加正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；AU處理組：細胞培養(yǎng)24 h后換含1×10-5mol·L-1桃葉珊瑚苷的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；UV+AU處理組：細胞培養(yǎng)24 h后以64 mJ·cm-2的UVB照射，用桃葉珊瑚苷終濃度為1×10-5mol·L-1的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。第48小時，取細胞和上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 HSF細胞分組 指數(shù)生長期的HSF細胞以每孔5×105個接種于6孔板，24 h后，換2.2.1四組細胞上清液培養(yǎng)24 h。

2.3 ELISA法檢測HaCaT細胞IL-6、TNF-α含量

HaCaT細胞給藥處理24 h后收集6孔板中各組細胞的上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、TNF-α的含量。

2.4 RT-PCR法檢測HSF細胞MMP-1、MMP-3 mRNA的表達

指數(shù)生長期HSF細胞按照2.2處理。第48小時，用TRIzol提取細胞的總RNA；用第一鏈cDNA合成試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA；以cDNA為模板進行PCR擴增，MMP-1引物F 5′- GGAAGGGCAAGGACTCTAT-3′、R 5′-CAGGGTTTC-AGCATCTGGT-3′，MMP-3引物F 5′-GCTGTGC-GTGGCAGTTTGC-3′、R 5′-AGCCTGGAGAATGTGA-GTGGAGT-3。50 μL反應體系，95 ℃變性2 min，95 ℃變性30 s，52 ℃和58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；取擴增產(chǎn)物5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳(100 V，30 min)，將凝膠放入ChampGel 5000型凝膠成像系統(tǒng)攝像，與內(nèi)參OD值相比得各處理組的相對含量。

2.5 Western-Blot檢測HSF細胞中MMP-1、MMP-3的含量

HSF細胞按照2.2處理，棄去培養(yǎng)液，用4 ℃預冷的PBS液洗滌3次，置冰上加入WIP裂解液150 μL裂解，12 000 g低溫離心，取上清液，加上樣緩沖液，沸水煮5 min，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；采用半干法將蛋白轉印至PVDF膜上；TBST浸濕后室溫封閉2 h；一抗4 ℃孵育過夜；TBST震蕩洗滌4次，每次5 min；二抗室溫孵育2 h；TBST震蕩洗滌4次，每次5 min；吸取多余TBST，將ECL發(fā)光液滴加在PVDF膜上，確保工作液覆蓋整張膜，吸去多余的工作液。將膜放入化學發(fā)光成像儀內(nèi)，曝光照相及圖像分析。

3 結果

3.1 對HaCaT細胞分泌IL-6、TNF-α的影響

由表1可以看出，UVB照射后HaCat細胞分泌IL-6、TNF-α的量升高，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；AU處理組與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，UV+AU處理組與UV照射組相比，含量降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 不同處理對HaCaT細胞分泌IL-6、TNF-α的影響

注：與UV照射組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；下同。

3.2 不同處理對HSF細胞MMP-1、MMP-3 mRNA表達的影響

UV照射組與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；AU處理組與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，UV+AU處理組與UV照射組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，結果見圖1、表2。

注：1.正常對照組；2.UV照射組；3.AU處理組；4.UV+AU處理組。圖1 各組細胞MMP-1、MMP-3 mRNART-PCR產(chǎn)物電泳圖

表2 不同處理對HSF細胞MMP-1、MMP-3 mRNA相對含量的影響

3.3 對HSF細胞MMP-1、MMP-3蛋白表達的影響

由圖2和表3得出：UV照射后MMP-1、MMP-3蛋白表達量增加，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；AU處理組與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，UV+AU處理組與UV照射組相比，MMP-1、MMP-3蛋白含量降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。

注：1.正常對照組；2.UV照射組；3.AU處理組；4.UV+AU處理組。圖2 各組細胞MMP-1、MMP-3 Western-Blot圖

表3 不同處理對HSF細胞MMP-1、MMP-3蛋白相對含量的影響

4 討論

UVB直接作用的靶部位為皮膚表皮的角質(zhì)形成細胞，刺激其分泌IL-6、TNF-α等多種細胞因子等[4-5]。這些細胞因子可直接作用于角質(zhì)形成細胞本身，放大炎癥反應，導致角質(zhì)形成細胞的進一步損傷，也可通過旁分泌機制作用于成纖維細胞，促進真皮成纖維細胞表達MMPS，加速光老化[1]。

本課題組前期實驗研究表明1×10-5mol·L-1的AU對UVB損傷的皮膚角質(zhì)形成細胞具有很好的保護作用，本次實驗進一步來驗證AU在此濃度下通過旁分泌機制對成纖維細胞的影響。UVB照射使HaCaT細胞分泌IL-6、TNF-α增多(P<0.01)，說明此照射劑量造成了角質(zhì)形成細胞的損傷，1×10-5mol·L-1的AU處理后，HaCat細胞分泌TNF-α、IL-6的量與空白對照相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，UVB照射HaCat細胞后加1×10-5mol·L-1的AU處理光損傷細胞，IL-6、TNF-α含量與UV照射組相比，分泌量明顯減少(P<0.01)，表明1×10-5mol·L-1的AU對正常HaCat細胞無明顯毒作用，但對UV損傷的HaCat細胞具有很好的保護作用。

取上述4個處理組的培養(yǎng)液加到處于對數(shù)生長期的HSF細胞中，UV照射組MMP-1、MMP-3的mRNA及蛋白的表達量增多，與空白對照相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，主要原因是因為UV照射組培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α含量多，IL-6、TNF-α等細胞因子通過細胞表面細胞因子受體活化MAPK信號通路，促進MMP-1、MMP-3的表達[6]。1×10-5mol·L-1的AU處理組的上清液對HSF細胞分泌MMP-1、MMP-3的量與正常對照組相比無差異，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明單純AU處理，對HSF細胞分泌MMP-1、MMP-3無顯著影響，UV+AU處理組的MMP-1、MMP-3與UV照射組相比，含量降低(P<0.05，P<0.01)，說明AU通過減少HaCat細胞分泌IL-6、TNF-α的量，抑制MMP-1、MMP-3過表達。

綜上，桃葉珊瑚苷即可通過減少炎癥細胞因子IL-6、TNF-α分泌來拮抗UV對角質(zhì)形成細胞的損傷，又可通過抑制旁分泌機制，保護成纖維細胞，抑制MMP-1、MMP-3的過表達，預防光老化。

[1] Brenneisen P，Sies H，Scharffetter-Kochanek K.Ultraviolet-B irradiation and matrix metalloproteinases：from inductionviasignaling to initial events[J].Ann N Y Acad Sci，2002，23(15)：2059-2076.

[2] 王小勇，畢志剛.IL-1對UVA輻射成纖維細胞基質(zhì)金屬蛋白酶表達的影響機制探討[J].中國皮膚性病學雜志，2005，19(9)：513-515，529.

[3] 陳巧云，王業(yè)秋，張寧.桃葉珊瑚苷對紫外線B波損傷皮膚角質(zhì)形成細胞的保護作用[J].中國藥學雜志，2014，49(7)：554-558.

[4] John D，Stuart J，Alexandra A O，et al.UV radiation and the skin[J].Int J Mol Sci，2013，14(6)：12222-12248.

[5] 劉海亮，包凱帆，江小燕，等.過敏性疾病關鍵啟動因子在人角質(zhì)形成細胞中表達的適宜刺激方法探索[J].中國藥理學通報，2015，31(4)：576-581.

[6] Kim W E，Yang H J，Youn H S，et al.Myricetin inhibits Akt survival signaling and induces Bad-mediated apoptosis in a low dose ultraviolet(UV)-B-irradiated HaCaT human immortalized keratinocytes[J].J Radiat Res，2010，51(3)：285-296.

InfluenceofHaCaTSecretionofCytokinesInducedbyUVBonHSFandProtectiveEffectofAucubin

CHENQiaoyun，WANGYeqiu，QIYonghua，LIJianmin*，ZHANGNing

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Jiamusi154007，China)

Objective：To investigate UVB-induced HaCaT secretion cytokines and the protective effect of the aucubin on HSF through paracrine mechanisms.MethodsThe aucubin was used for normal and photoaging HaCaT cells，IL-6，TNF-α contents were detected by ELISA.The supernatant was applied to HSF cells，MMP-1，MMP-3 mRNA and protein expression was detected in RT-PCR and Western-Blot.ResultsAucubin had no significant effect on content of IL-6 and TNF-αsecreted by normal HaCaT cells，while photoaging HaCaT was significantly inhibited (P<0.01).Photoaging HaCaT medium increased MMP-1，MMP-3 mRNA and protein expression in HSF，aucubin treatment group could significantly inhibited this effect (P<0.01).ConclusionAucubin can protect keratinocytes by reducing the inflammatory cytokines IL-6，TNF-αsecreting，meanwhile inhibiting MMP-1，MMP-3 over expression by the paracrine mechanisms to protect fibroblast cells.

Aucubin；HaCaT cells；HSF cells；photoaging

2016-04-05)

國家自然科學基金(81274035)；黑龍江省應用技術研究與開發(fā)計劃項目(PC13S15)；黑龍江中醫(yī)藥大學校基金(201309)；黑龍江中醫(yī)藥大學創(chuàng)新人才支持計劃項目(2012)；黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院基金(2014)

*

李建民，教授，研究方向：中藥藥理；E-mail：ljm_1030@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.006