二肽基肽酶Ⅱ在老年性白內障患者晶狀體中表達及臨床意義

吳　怡　田　蕊　李　卉　竇文文　張　輝

(吉林大學第二醫院，吉林　長春　130041)

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二肽基肽酶Ⅱ在老年性白內障患者晶狀體中表達及臨床意義

吳怡田蕊李卉竇文文張輝

(吉林大學第二醫院，吉林長春130041)

目的檢測二肽基肽酶(DPP)Ⅱ在不同病程的老年性白內障患者晶狀體中的表達及酶活性變化，探討DPPⅡ與老年性白內障發病的關系。方法晶狀體混濁程度不同的老年性白內障患者根據晶狀體核硬度不同進行分組。Western印跡法檢測DPPⅡ在各組晶狀體中的表達變化，應用蛋白酶活性測定DPPⅡ紫外吸光度，計算DPPⅡ在各組晶狀體中的酶活性變化。結果隨著老年性白內障患者晶狀體核硬度的增加，DPPⅡ的表達增加，同時，DPPⅡ的酶活性增強。結論DPPⅡ隨晶狀體核硬度增加而呈現表達及酶活性的變化與老年性白內障進展有關。

二肽基肽酶(DPP)Ⅱ;晶狀體;酶活性;老年性白內障

二肽基肽酶(DPP)Ⅱ是一種廣泛分布于哺乳動物的細胞內溶酶體外切肽酶，由兩個分子量為50～65 kD的亞單位組成的二聚體〔1，2〕，在細胞死亡與蛋白降解中發揮作用〔3〕。在半乳糖性白內障大鼠及SCR先天性白內障大鼠晶狀體中，DPPⅡ的表達均高于正常對照組大鼠，且隨晶狀體混濁程度的增加，DPPⅡ的表達呈上升趨勢〔4，5〕。DPPⅡ在老年性白內障患者晶狀體中的表達變化尚未見報道。本研究檢測不同核硬度的晶狀體中DPPⅡ的表達及酶活性的變化及其與老年性白內障的關系。

1　資料與方法

1.1一般資料2009年我院白內障科診治的老年性白內障患者20例，均行小切口白內障囊外摘除術，收集術中取出的晶狀體共20枚。術前已進行詳細的全身檢查及專科檢查，排除其他類型的白內障。其中男12例，女8例；年齡65～74歲，平均71歲。根據晶狀體核硬度及顏色將20枚晶狀體分為A組9枚，核呈黃白色、黃色或深黃色，軟核或中等硬度核。B組11枚，核呈棕色、琥珀色、棕褐色甚至黑色，硬核或極硬核。

1.2Western印跡法檢測晶狀體中DPPⅡ的表達 隨機選取兩組晶狀體各1枚，在玻璃勻漿器內與1 ml蛋白裂解液混合冰上勻漿攪碎，所獲混合液4℃離心(3 000 r/min，20 min)，取上清，分裝，-80℃冰箱保存。聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法制定標準蛋白曲線，測定總蛋白濃度，調平后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕性電轉、蛋白印跡及顯色反應。其中，DPPⅡ一抗(1∶1 000)，4°搖床搖3.5 h，DPPⅡ二抗(1∶2 000)，室溫下搖床搖2 h。二氨基聯苯胺(DAB)顯色液顯色，照相，封存。最后利用Bandscan灰度掃描軟件3次掃描后取均值。

1.3DPPⅡ在老年性白內障患者晶狀體中蛋白酶活性的測定在測定液(bestatin和leuhistin的混合液)中加DPPⅡ酶樣品和Tris-HCl緩沖液，37℃預孵育后加入合成底物Lys-Ala-PNA，反應5 min，加乙酸鈉緩沖液(pH 4.0)、10% Tween 20，0.1%石榴紅硫酸鹽終止反應。5 min后用正丁醇萃取紅色，用UV-2500 PC在525 nm、37℃測定紫外光密度(OD)值。按下面公式計算DPPⅡ的酶活性：活性=(OD 525×109×2.0×10-3×10)/(e×t)(nmol·min-1·L-1)。其中e為4-mβ苯胺的摩爾消光系數；t為測定時間；2.0×10-3為正丁醇的體積換算單位L；109μmol換算為nmol；×10為加的酶100 μl換算為ml。

1.4統計學處理采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2　結　果

2.1DPPⅡ在老年性白內障患者晶狀體中的表達DPPⅡ蛋白條帶出現在分子量約為60 kD大小的位置，B組DPPⅡ的表達較A組增加，見圖1。在老年性白內障患者晶狀體中，隨晶狀體核硬度的增加，DPPⅡ的表達增加。見表1。

圖1　DPPⅡ在老年性白內障患者晶狀體中的表達

組別n峰灰度總灰度Log總灰度A組99455±9811437725±2156.95±0.17B組1115267±911)16158992±4071)7.29±0.091)

與A組比較：1)P<0.05；下表同

2.2DPPⅡ在老年性白內障患者晶狀體中酶活性的變化隨著老年性白內障患者晶狀體核硬度的增加，DPPⅡ的酶活性增強。見表2。

表2　DPPⅡ在老年性白內障患者晶狀體中酶活性的變化

3　討　論

老年性白內障是晶狀體老化的退行性改變，是多種原因作用的結果，例如氧化損傷，長期紫外線照射，鈣-鈣蛋白異常等。晶狀體中α-晶狀體蛋白具有分子伴娘功能〔6〕，它能抑制酶的化學修飾并保護酶的活性，從而維持晶狀體的透明性。當晶狀體老化時，色素在核內蓄積〔7〕，同時不可溶性蛋白質增加〔8〕，分子伴娘作用下降，透明度降低。白內障的發生可能與晶狀體中某些蛋白酶的含量及活性密切相關。早期的研究已證實DPPⅡ存在于嚙齒類動物的晶狀體中〔9，10〕，在大鼠、豬、牛和人的晶狀體中分別檢測出DPPⅡ的生化活性，并推測其與白內障發病有關〔11，12〕。本實驗表明DPPⅡ在晶狀體進行性混濁中發揮著某種作用。隨著晶狀體混濁程度的加重，αB-晶狀體蛋白被切除后發生了多種化學修飾，使其可溶性成分減少，不溶性成分增加〔13，14〕。推測：晶狀體中的一些關鍵蛋白質可被一些激活的內切肽酶降解而暴露出特異性氨基酸序列的多肽片段(如Lys-Pro，Arg-Pro等)，這些片段可能進一步被DPPⅡ等外切肽酶識別后水解或發生化學修飾，導致晶狀體蛋白質結構或排列發生變化，改變晶狀體蛋白質的透明性，造成白內障混濁加重，其作用及機制尚有待實驗研究。

1Carrell RW，Lomas DA.Conformational disease 〔J〕.Lancet，1997；350(9071)：134-8.

2Chiravuri M，Lee H，Mathieu SL,etal.Homodimerization via a leucine zipper motif is required for enzymatic activity of quiescent cell proline dipeptidase 〔J〕.Biol Chem，2000；275 (35)：26994-9.

3Maes MB，Scharpe S，De Meester I.Dipeptidyl peptidase Ⅱ (DPPⅡ)，a review 〔J〕.Clin Chim Acta，2007；380(1-2)：31-49.

4Zhang H，Yamamoto Y，Shumiya S，etal.Peptidases play an important role in cataractogenesis：an immunohistochemical study on lenses derived from Shumiya cataract rats 〔J〕.Histochem J，2001；33(9-10)：511-21.

5田蕊，張輝，于維芹，等.二肽基肽酶Ⅱ在半乳糖性白內障大鼠晶狀體中的表達〔J〕.國際眼科雜志，2008；7(4)：698-700.

6Horwitz J.Alpha-cystallin can function as a molecular chaperone 〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，1992；89(21)：10449-53.

7李鳳鳴.眼科全書〔M〕.北京：人民衛生出版社,1996：1611-3.

8何守志.晶狀體病學〔M〕.北京：人民衛生出版社,2004：2-3,16-7.

9Sentandreu MA，Toldra F.Partial purification and characteri-sation of dipeptidyl peptidase Ⅱ from porcine skeletal muscle〔J〕.Meat Sci，2001；57(1)：93-103.

10Swanson AA，Davis RM，Meinhardt NC.Proteases in human lenses and their possible significance〔J〕.Curr Eye Res,1985；4(1)：43-8.

11Willis C，Gorthy，Daniel E，etal.Localization of the lysosomal protease dipeptidyl peptidase Ⅱ in the young normal rat lens：a correlative light and electron microscopic analysis〔J〕.Curr Eye Res，1992；11(6)：531-42.

12Willis C，Gorthy，Parviz A.Biochemical and histochemical evidence for lysosomal proteases in Rodent lenses〔J〕.Exp Eye Res，1987；44(6)：747-53.

13張輝，趙梅生，于維芹，等.αB-晶狀體蛋白在先天性白內障大鼠晶狀體中的免疫活性變化〔J〕.眼科新進展，2006；26(12)：893-5.

14張旭，鄒尉玉.αB-晶體蛋白在半乳糖性白內障晶狀體中的表達〔J〕.眼科新進展，2003；23(6)：575-8.

〔2015-02-19修回〕

(編輯苑云杰)

張輝(1966-)，女，博士，教授，主要從事白內障研究。

吳怡(1982-)，女，碩士，主治醫師，主要從事白內障研究。

R776

A

1005-9202(2016)18-4570-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.084