溴結構蛋白4在食管鱗癌中的表達及JQ-1對其活性的抑制作用

吳　丹　呂　望　虞　莉　周振宇　胡耶基　胡　堅

(浙江大學醫學院附屬第一醫院，浙江　杭州　310006)

?

溴結構蛋白4在食管鱗癌中的表達及JQ-1對其活性的抑制作用

吳丹呂望虞莉周振宇胡耶基胡堅

(浙江大學醫學院附屬第一醫院，浙江杭州310006)

目的探討溴結構蛋白(BRD)4在食管鱗癌中的表達特征及靶向抑制內源性BRD4的活性對食管鱗癌細胞增殖的影響及作用機制。方法免疫組化染色檢測80例食管鱗癌和配對癌旁組織中BRD4的表達情況，分析BRD4的表達與臨床病理特征的關系，分析其在預后評估中的價值。小分子抑制劑JQ-1作用于食管鱗癌細胞EC109，MTT分析抑制內源性BRD4的活性對細胞增殖的影響；流式細胞術分析JQ-1干預對細胞凋亡的影響；Western印跡檢測細胞凋亡相關蛋白表達的變化。結果BRD4陽性表達于細胞質和細胞核，癌組織較癌旁組織表達顯著增高；BRD4的表達與食管鱗癌的分化程度、淋巴結轉移和病理分期顯著相關(P<0.01)，BRD4高表達的患者預后不良。JQ-1顯著抑制食管鱗癌細胞的增殖；JQ-1干預24 h，EC109細胞的凋亡率顯著上升；細胞凋亡執行蛋白cleaved-caspase3和cleaved-PARP1表達顯著上調。結論BRD的表達與食管鱗癌疾病進展明確相關，是潛在的預后評估標記物；抑制內源性BRD的活性通過誘導細胞凋亡抑制食管鱗癌細胞的增殖。因此，BRD4是潛在的食管鱗癌治療靶點。

食管鱗癌；溴結構蛋白(BRD)4

食管癌居我國癌癥死亡率第四位，每年新發病例超過25萬〔1〕。我國食管癌的主要病理類型是鱗癌，因食管鱗癌惡性程度高、病程進展迅速、易復發轉移，患者總體預后仍然較差〔2〕。溴結構蛋白(BRD)4是box基因家族轉錄因子(BET)家族的一員，含有兩個溴結構域和一個超末端結構〔3〕。近來研究發現，BRD4表達的失調或功能紊亂與黑色素瘤、急性髓系白血病、結腸癌、乳腺癌等腫瘤的發生有關，BRD4 shRNA或BET抑制劑可以誘導腫瘤細胞發生周期阻滯、凋亡或分化，顯示出強大的抗腫瘤活性〔4～6〕。這些研究表明，BRD4有望成為腫瘤治療的新靶點。本研究探討BRD4在食管鱗癌中的表達情況及小分子抑制劑JQ-1對食管鱗癌細胞內源性BRD4活性的抑制作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料選取2006年1月至2015年12月慈溪市人民醫院經手術切除的80例Ⅰ～Ⅲ期(AJCC 2009年版)食管鱗癌患者，Ⅰ期6例、Ⅱ期38例、Ⅲ期36例，年齡48～82歲，平均年齡64.7歲。所有病例術前均未行放化療，無其他腫瘤史，臨床及病理資料完整；癌旁組織選擇距癌組織邊緣>5 cm處，所有標本經10%中性甲醛固定，常規脫水后石蠟包埋，每例病理切片均經兩位病理醫師確診。術后開始隨訪，截止于2015年12月，失訪5例，隨訪率為93.4%。

1.1.2藥物和細胞株JQ-1購自Selleckchem公司(純度≥98%)；用二甲基亞砜(DMSO)配成50 mmol/L的母液，-20℃保存，使用時用培養液稀釋至目標濃度。人食管鱗癌細胞EC109購自中國科學院細胞庫。

1.1.3試劑胎牛血清、DMEM培養液、0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)購自CORNING公司；噻唑藍(MTT)、牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自BD Pharmingen公司；兔抗人BRD4、cleaved-caspase3、cleaved-PARP1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG抗體均購自為Abcam公司產品；免疫組化檢測試劑盒和二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒購自DAKO公司；電化學發光法(ECL)發光試劑購自Bio-Rad公司。

1.1.4主要儀器石蠟切片機(Thermo公司)，病理組織烘漂處理儀(Thermo公司)，BX41光學顯微鏡(OLYMPUS公司)，顯微成像系統(OLYMPUS公司)，細胞培養箱(Thermo公司)，iMARK酶標儀(Bio-Rad公司)，CytoFLEX流式細胞儀(Beckman公司)，垂直電泳及蛋白轉膜裝置(Bio-Rad公司)，凝膠成像系統(Bio-Rad公司)。

1.2實驗方法

1.2.1免疫組化染色分析食管組織BRD4蛋白的表達石蠟切片在60℃烤箱中烤2 h，經脫蠟、水化、抗原修復、3%羊血清封閉后，加兔抗人BRD4多克隆抗體(1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗片后加生物素化的二抗及鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶(SABC)復合物，室溫反應30 min，洗片后DAB顯色，蘇木素復染，經脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察組織染色情況并拍照。結果判斷：陽性定位，BRD4蛋白主要表達于細胞質和細胞核，呈棕黃色顆粒。定性：在切片中染為淡黃色至棕黃色作為陽性標志；將陽性細胞數分為4類：(-)為陽性細胞<1%；(+)為陽性細胞占1%～24%；()為陽性細胞占25%～50%；()為陽性細胞>50%；綜合染色強度和陽性細胞數判定食管組織BRD4蛋白高表達和低表達。

1.2.2細胞培養EC109細胞以含10%胎牛血清的DMEM完全培養液，培養于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中。

1.2.3MTT實驗分析JQ-1的細胞毒作用EC109細胞按每孔1×104個接種于96孔培養板，細胞貼壁后棄去上清，加入100 μl含20、40、80和120 μmol/L JQ-1的含藥培養液，每組設3個復孔，空白對照組加入等體積的完全培養液。藥物作用24 h，MTT法分析JQ-1對細胞生長的影響，酶標儀測定各孔490 nm處吸光度值(A)，計算細胞存活率(%)，實驗重復3次。

1.2.4流式細胞術檢測凋亡率EC109細胞以每孔3×105個細胞接種于6孔板。細胞貼壁后，實驗組加入40、80、120 μmol/L濃度的含藥培養液，空白對照組加入等體積的完全培養液。JQ-1作用24 h，收集各組細胞，取100 μl單細胞懸液，加入Annexin V-FITC(5 μl)和PI(10 μl)混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μl 1×結合緩沖液，上機檢測細胞凋亡率。

1.2.5Western印跡檢測凋亡相關蛋白的表達細胞培養及藥物處理同1.2.4。提取JQ-1作用24 h的各組細胞總蛋白，DC法測定蛋白質濃度。取各實驗組20 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠-十二烷基硫酸鈉(PAGE-SDS)電泳，250 mA恒流電轉移至PVDF膜。10%脫脂奶粉溶液封閉1 h，多克隆抗cleaved-caspase3、cleaved-PARP1和GAPDH抗體(1∶1 000)室溫孵育2 h，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，HRP標記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜。滴加ECL試劑于凝膠成像系統內曝光，分析目的蛋白的表達。

1.3統計學方法應用SPSS20.0軟件，采用χ2檢驗分析BRD4的表達情況與臨床病理特征的關系，單因素分析采用Kaplan-Meier法，組間比較用Log-rank檢驗，其他計量資料采用t檢驗。

2　結　果

2.1食管鱗癌組織和癌旁組織中BRD4的表達情況80例食管鱗癌組織BRD4高表達34例(42.5%)，癌旁組織BRD4高表達有16例(20.0%)，兩者比較差異顯著(P<0.01)。見圖1。

2.2BRD4在食管鱗癌組織中的表達與臨床特征的關系BRD4的表達與年齡、性別和T分期無相關性(P>0.05)，與食管鱗癌的分化程度、N分期和病理分期密切相關(P<0.05)。見表1。

圖1　食管鱗癌和癌旁組織BRD4表達(DAB，×200)

臨床病理特征n高表達低表達χ2值P值年齡(歲) <653615210.0190.892 ≥65441925性別 男5624320.0100.921 女241014分化程度 中-高分化5719386.8170.009 低分化23158T分期 T1,T2153123.8250.051 T3,T4653134N分期 N04212307.0200.008 N1,N2,N3382216病理分期 Ⅰ,Ⅱ4613338.9800.003 Ⅲ342113

2.3BRD4在食管鱗癌組織中的表達與預后的關系34例BRD4高表達的患者1年累積生存率為73.5%，3年累積生存率為11.8%，5年累積生存率為8.8%；46例BRD4低表達的患者1年累積生存率為78.3%，3年累積生存率為50.0%，5年累積生存率為34.8%；BRD4蛋白低表達組的5年生存率明顯高于高表達組(P=0.001)。Kaplan-Meier單因素分析提示，BRD4表達、淋巴結是否轉移、T分期和病理分期是影響總生存預后的獨立因素(P<0.05)，見圖2。

圖2　不同BRD4蛋白表達食管鱗癌患者的積累生存率比較

2.4JQ-1抑制食管鱗癌細胞EC109的增殖不同濃度的JQ-1干預細胞24 h，明顯抑制EC109細胞的增殖，呈劑量依賴關系。空白對照組設為1，20、40、80、120 μmol/L JQ-1組EC109細胞增殖率分別為(101.5±6.5)%、(87.2±5.2)%、(42.3±4.8)%、(5.6±2.2)%。

2.5JQ-1誘導食管鱗癌細胞凋亡JQ-1作用24 h，EC109細胞凋亡率(含早期凋亡和晚期凋亡)與空白對照組〔(2.6±4.5)%〕相比顯著上升(P<0.01)，40、80、120 μmol/L JQ-1組凋亡率分別為(8.1±5.2)%，(49.7±6.3)%，(99.7±1.0)%。

2.6JQ-1上調食管鱗癌細胞表達凋亡相關蛋白JQ-1干預24 h，EC109細胞表達caspase3和PARP1的剪切活化片段cleaved-caspase3和cleaved-PARP1顯著增加。見圖3。

圖3　JQ-1促進EC109細胞表達凋亡相關蛋白

3　討　論

BRD4蛋白是BET家族的一員，bromodomain蛋白BET通過與乙酰化的賴氨酸結合，參與胞核大分子的裝配及與染色質的結合，調節DNA的復制、DNA損傷修復、染色質重塑和基因轉錄等過程〔7〕。最新研究證實，BRD4的表達異常與多種腫瘤的發生發展密切相關〔4～6〕。Liao等〔8〕報道，BRD4的表達與非小細胞肺癌的組織學分型、分化程度、淋巴結轉移和病理分期相關，與患者的預后不良相關。Yan等〔9〕發現，BRD4的表達與膀胱尿路上皮癌(UCB)的分化程度、淋巴結轉移和遠處轉移相關，是UCS的一個獨立預后因素。目前，BRD4蛋白在食管鱗癌預后預測中的價值未見報道，本研究發現BRD4作為生物標記物在食管鱗癌中具有重要的臨床預測價值。由于本研究的樣本量偏少，期待今后的研究能夠增加樣本量，以獲得更有說服力的結果。

BET抑制劑具有誘導腫瘤細胞周期阻滯、凋亡以及細胞分化的作用，顯示出強大的抗腫瘤活性〔5〕。本文發現，BRD4抑制

劑JQ-1抑制食管鱗癌細胞EC109的增殖；JQ-1作用24 h，實驗組細胞凋亡率和凋亡相關蛋白cleaved-caspase3和cleaved-PARP1表達水平均顯著增高。在凋亡信號傳遞過程中，caspase3處于信號通路的樞紐位置，具有執行細胞凋亡的功能。酶原形式的caspase3被剪切成17 kD/19 kD的活性二聚體，進而將底物PARP1水解成89和24 kD的片段，使其失去修復DNA損傷的功能，導致受PARP1負調控的核酸內切酶活性增高，降解核小體DNA引起凋亡〔10〕。本研究提示，抑制內源性BRD的活性通過誘導細胞凋亡抑制食管鱗癌細胞的增殖，因此，BRD4是潛在的食管鱗癌治療靶點。

近來研究發現，BRD4的bromodomain Ⅱ可與雙乙酰化的Twist(Twist K73ac/K76ac)結合，同時BRD4的bromodomain Ⅰ與組蛋白H4 K5ac/K8ac結合，從而在Wnt5a的啟動子和增強子上形成Twist/BRD4/P-TEFb/RNA-Pol Ⅱ復合物激活其轉錄；促進基底樣乳腺癌(BLBC)細胞上皮間質轉化(EMT)和侵襲性生長〔11〕。BRD4是否具有介導食管鱗癌獲得EMT表型的功能，JQ-1靶向抑制BRD4的活性是否具有抑制食管鱗癌侵襲轉移的作用效應有待進一步研究。

1Chen W,Zheng R,Baade PD,etal.Cancer statistics in China,2015〔J〕.CA Cancer J Clin,2016;66(2):115-32.

2Wei WQ,Chen ZF,He YT,etal.Long-term follow-up of a Community Assignment,one-time endoscopic screening study of esophageal cancer in China〔J〕.J Clin Oncol,2015;33(17):1951-7.

3Devaiah BN,Singer DS.Two faces of brd4:mitotic bookmark and transcriptional lynchpin〔J〕.Transcription,2013;4(1):13-7.

4Fu LL,Tian M,Li X,etal.Inhibition of BET bromodomains as a therapeutic strategy for cancer drug discovery〔J〕.Oncotarget,2015,6(8):5501- 16.

5Roti G,Stegmaier K.New approaches to target T-ALL〔J〕.Front Oncol,2014;2014:4170.

6De Raedt T,Beert E,Pasmant E,etal.PRC2 loss amplifies Ras-driven transcription and confers sensitivity to BRD4-based therapies〔J〕.Nature,2014;514 (7521):247-51.

7Jonkers I,Lis JT.Getting up to speed with transcription elongation by RNA polymerase Ⅱ〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol,2015;16(3):167-77.

8Liao YF,Wu YB,Long X,etal.High level of BRD4 promotes non-small cell lung cancer progression〔J〕.Oncotarget,2016;7(8):9491-500.

9Yan Y,Yang FQ,Zhang HM,etal.Bromodomain 4 protein is a predictor of survival for urothelial carcinoma of bladder〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2014;7(7):4231-8.

10Shalini S,Dorstyn L,Dawar S,etal.Old,new and emerging functions of caspases〔J〕.Cell Death Differ,2015;22(4):526-39.

11Shi J,Cao J,Zhou BP.Twist-BRD4 complex:potential drug target for basal-like breast cancer〔J〕.Curr Pharm Des,2015;21(10):1256-61.

〔2015-09-17修回〕

(編輯袁左鳴)

慈溪市科技計劃項目(CN2015020)

胡堅(1964-)，男，主任醫師，教授，主要從事消化道腫瘤研究。

吳丹(1978-)，男，副主任醫師，現工作于溫州醫科大學附屬慈溪醫院，主要從事消化道腫瘤研究。

R735

A

1005-9202(2016)18-4515-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.055