鈣蛋白酶-2和鈣調神經磷酸酶蛋白表達與老年瓣膜病患者心房顫動發(fā)生的關系

李　巖　唐　芳

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，新疆　石河子　832008)

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鈣蛋白酶-2和鈣調神經磷酸酶蛋白表達與老年瓣膜病患者心房顫動發(fā)生的關系

李巖唐芳

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832008)

目的探討鈣蛋白酶-2和鈣調神經磷酸酶蛋白表達與老年瓣膜病患者心房顫動發(fā)生的關系。方法選取因瓣膜病接受瓣膜置換術的老年患者46例，收集術前臨床資料，根據(jù)心律情況分為竇性心律組(20例)、房顫組(26例)。以外科換瓣手術取下的右心耳肌組織為研究標本，蛋白印跡法檢測鈣蛋白酶-2、鈣調神經磷酸酶蛋白表達水平。結果房顫組患者心率、服用地高辛比例均明顯高于竇性心律組(P<0.05)；超聲心動圖檢查結果顯示，房顫組患者左心房內徑厚度明顯大于竇性心律組(P<0.05)。房顫組患者心肌組織中鈣蛋白酶-2表達水平明顯高于竇性心律組(P<0.05)，鈣調神經磷酸酶脂蛋白催化亞基的全長分子(分子質量60 000)和不含自抑區(qū)的活性分子片段(分子質量45 000)表達水平明顯高于竇性心律組(P<0.05)。結論鈣蛋白酶-2-鈣調神經磷酸酶信號通路參與老年瓣膜性房顫的發(fā)生。

心房顫動；鈣蛋白酶-2；鈣調神經磷酸酶蛋白

鈣調神經磷酸酶是一種依賴Ca2+/鈣調蛋白調節(jié)的蛋白磷酸酶。鈣蛋白酶-2是Ca2+依賴性半胱氨酸蛋白酶，能夠催化多種底物限制性水解〔1〕。鈣調神經磷酸酶是鈣蛋白酶-2底物之一，能被鈣蛋白酶-2水解為不含自抑區(qū)結構的活化形式，活性不受Ca2+濃度調節(jié)〔2〕。最新研究顯示，鈣調神經磷酸酶蛋白-活化T細胞核因子信號通路參與了房顫的發(fā)生〔3〕。瓣膜性房顫主要由心腔壓力改變等因素引起，與非瓣膜性房顫的傳導系統(tǒng)退行性變化不同，鈣調神經磷酸酶蛋白信號通路是否參與了瓣膜性房顫的發(fā)生尚未見報道。本研究通過檢測老年瓣膜病患者右心耳組織中鈣蛋白酶-2和鈣調神經磷酸酶蛋白表達水平，探討其與瓣膜性房顫發(fā)生的關系。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2014年1月至2015年6月間來本院心外科因瓣膜病接受瓣膜置換術的老年患者46例，男27例，女19例，年齡60～78〔平均(64.82±6.39)〕歲；包括二尖瓣關閉不全8例、單純二尖瓣狹窄4例、二尖瓣狹窄合并關閉不全11例、主動脈瓣關閉不全2例、主動脈瓣狹窄合并關閉不全2例，多瓣膜病19例。記錄患者體質量、血壓、心率、心電圖等臨床資料，根據(jù)心電圖顯示的心律情況分為竇性心律組(20例)、房顫組(26例)。本次研究獲得本院倫理委員會審核批準，入選患者均簽署知情同意書。

1.2標本采集和檢測在換瓣手術建立體外循環(huán)心臟停搏之前，取患者右心耳組織，放于液氮中速凍后轉移到-80℃超低溫冰箱保存。采用蛋白印跡法檢測右心耳組織中鈣蛋白酶-2和鈣調神經磷酸酶蛋白表達水平：取右心耳組織30 mg，在預冷的研缽中研磨后轉入2.0 ml EP管中，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液200 μl，混合均勻，低溫孵育45 min，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液。BCA法測定蛋白濃度，用裂解液將各蛋白樣品調節(jié)至相同濃度，加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液后120℃變性15 min，取等體積和總量的樣品上樣，80 V、9%～10% SDS-PAGE凝膠垂直電泳分離30 min，進入分離膠后100 V電泳60 min，4℃、100 mA電轉印到PVEF膜上，置于5%脫脂牛奶Tris鹽酸緩沖液(TBST)中，室溫條件下封閉60 min，棄封閉液后加入一抗(鼠抗人鈣調神經磷酸酶單抗、兔抗人鈣蛋白酶-2多抗、鼠抗人β-actin抗體)，孵育過夜。次日，洗膜3次、10 min/次，用辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠/兔二抗，104倍稀釋于5%脫脂牛奶，室溫孵育60 min，洗膜3次，加入化學增強發(fā)光法(ECL)發(fā)光劑，室溫下反應、顯影、掃描。采用發(fā)光成像分析儀測定條帶的灰度值，以β-actin為內參，將其與各條帶灰度值的比值作為蛋白表達的相對水平。

1.3統(tǒng)計學方法應用SPSS15.0統(tǒng)計學分析行t或χ2檢驗。

2　結　果

2.1兩組患者臨床特征比較房顫組患者心率、服用地高辛比例均明顯高于竇性心律組。左心房內徑厚度明顯大于竇性心律組(P<0.05)；其余各項指標兩組間均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

表1　竇性心律組和房顫組患者臨床特征比較±s)

2.2兩組患者鈣蛋白酶-2和鈣調神經磷酸酶蛋白表達水平比較房顫組患者心肌組織中鈣蛋白酶-2表達水平為(0.84±0.39)，明顯高于竇性心律組(0.49±0.20)(P<0.05)。房顫組鈣調神經磷酸酶脂蛋白催化亞基的全長分子(分子質量60 kD)和不含自抑區(qū)的活性分子片段(分子質量45 kD)表達水平分別為1.26±0.48、1.10±0.33，明顯高于竇性心律組0.80±0.32、0.80±0.21(P<0.05)。見圖1。

1、2、3為竇性心律組，4、5、6為房顫組圖1　兩組患者鈣蛋白酶-2和鈣調神經磷酸酶蛋白表達水平

3　討　論

鈣調神經磷酸酶活性受Ca2+調節(jié)，可被環(huán)孢素A等免疫抑制劑抑制，在真核生物組織中廣泛存在，人體心肌組織等多種類型細胞中均有表達〔4〕。鈣調神經磷酸酶由一個催化亞基和一個調節(jié)亞基共同構成，催化亞基又包括3個異構體，其中α、β存在于哺乳動物體內組織和器官中，γ存在于睪丸中〔5〕。由于鈣調神經磷酸酶主要通過催化亞基發(fā)揮生物學效應，本次研究通過檢測其催化亞基蛋白的表達來反映鈣調神經磷酸酶蛋白表達情況。鈣調神經磷酸酶催化亞基主要由4部分構成，分別為催化區(qū)、自抑區(qū)、調節(jié)區(qū)、結合區(qū)。非活化狀態(tài)下，催化區(qū)被自抑區(qū)封閉，當Ca2+濃度達到一定程度時，調節(jié)區(qū)、結合區(qū)結合到催化區(qū)，使催化區(qū)構象改變，自抑區(qū)釋放，催化區(qū)暴露，鈣調神經磷酸酶被激活〔6〕。因此Ca2+濃度能夠可逆性調控鈣調神經磷酸酶表達。

本次研究中，老年瓣膜性房顫患者心肌組織中鈣調神經磷酸酶催化亞基全長分子(分子質量60 000)蛋白表達水平明顯高于瓣膜病竇性心律患者。結合最新研究發(fā)現(xiàn)，瓣膜性房顫患者的心肌組織中鈣調神經磷酸酶 mRNA和活化T細胞核因子mRNA表達水平上調，推論鈣調神經磷酸酶-活化T細胞核因子信號通路參與了瓣膜性房顫的發(fā)生〔7〕。可能機制為鈣調神經磷酸酶蛋白表達上升，活性增加，而活化T細胞核因子為鈣調神經磷酸酶最重要的底物，活化的鈣調神經磷酸會使T細胞核因子氨基酸末端調節(jié)區(qū)域去磷酸化，暴露其定位信號而轉入細胞核內，與多種轉錄因子共同調控相關基因的轉錄，參與房顫的發(fā)生。鈣調神經磷酸酶-活化T細胞核因子信號通路中鈣調神經磷酸酶的活性調節(jié)除蛋白表達提升之外，鈣蛋白酶-2也可能參與。鈣蛋白酶-2活化后可水解為數(shù)百種蛋白，鈣調神經磷酸酶蛋白就是其中一個底物。當多種原因使細胞中的Ca2+濃度上升到一定程度時，鈣蛋白酶-2被激活，進而使鈣調神經磷酸酶催化亞基在N-末端第402位點出現(xiàn)水解，鈣調神經磷酸酶失去自抑區(qū)，成為結構上的活化形式，相對分子質量為45 000，為不可逆性激活。

本次研究還證實了鈣調神經磷酸酶失去自抑區(qū)蛋白表達上調，說明鈣蛋白酶-2參與了鈣調神經磷酸酶-活化T細胞核因子信號通路中鈣調神經磷酸酶的活性調節(jié)。鈣蛋白酶-2蛋白表達增加可能與左心房壓力高、心房肌細胞內鈣超載有關。

1高鵬,方全,王佳麗,等.非瓣膜病心房顫動患者抗凝不足狀況及原因分析〔J〕.中華心血管病雜志,2013;41(11):931-4.

2Kim JY,Lee SJ,Kim JH,etal.Effects of atrial fibrillation on the outcome of the rehabilitation inpatients with cerebral infarction〔J〕.Ann Rehabil Med,2014;38(6):766-74.

3Furman JL,Norris CM.Calcineurin and glial signaling：neuroinflammation and beyond〔J〕.J Neuroinflam,2014,11(2):158.

4馮衛(wèi)中.風濕性瓣膜病合并冠心病的外科治療〔D〕.鄭州：鄭州大學,2011.

5陳景偉,程可洛.保留全瓣及瓣下結構的二尖瓣置換術治療老年退行性瓣膜病的進展〔J〕.醫(yī)學綜述,2015;21(7):1248-50.

6Akkaya M,Marrouche N,Higuchi K,etal.The degree of left atrial structural remodeing impacts left ventricular rejection fraction in patients with atrial fibrillation〔J〕.Turk Kardiyol Dern Am,2014;42(1):11-9.

7趙科研,尹宗濤,李新民,等.老年瓣膜病合并重度肺動脈高壓行瓣膜手術的療效〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(21):6091-3.

〔2016-02-10修回〕

(編輯袁左鳴)

新疆建設兵團科技局2014年科技計劃項目(No.2014BA036)

李巖(1975-)，女，主管護師，主要從事老年患者臨床護理研究。

R54

A

1005-9202(2016)18-4454-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.022