11β-羥基類固醇脫氫酶1型、促酰化蛋白在肥胖大鼠伴高脂血癥形成中的機制

吳國瓊　林　梅　張　雨　郭菲菲　候亞莉　邱　璇　鄧春地　楊艷群　袁惠萍

(武漢市普愛醫院(西院)內分泌科，湖北　武漢　430034)

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11β-羥基類固醇脫氫酶1型、促酰化蛋白在肥胖大鼠伴高脂血癥形成中的機制

吳國瓊林梅張雨郭菲菲候亞莉邱璇鄧春地楊艷群袁惠萍

(武漢市普愛醫院(西院)內分泌科，湖北武漢430034)

目的11β-羥基類固醇脫氫酶1型(11β-HSD1)、促酰化蛋白(ASP)在肥胖伴高脂血癥中的機制。方法隨機選取SD雄性大鼠60只，均分為實驗組和對照組，實驗組施以高脂飲食，對照組常規飲食，觀察1～8 w進食量、體重和血壓的變化；并在8 w后檢測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平。處死動物取其肝臟，利用RT-PCR方法測量組織中11β-HSD1、脂蛋白酯酶(LPL)mRNA的變化，利用轉染技術轉染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細胞并與不同濃度ASP培養，以正常脂肪細胞作為對照，觀察細胞凋亡和細胞活性。結果實驗組食量先下降后上升，而對照組逐漸下降；實驗組體重急劇上升，且大于對照組；實驗組血壓逐漸上升，而對照組維持一定水平；在第8周，實驗組血脂水平顯著高于對照組；實驗組11β-HSD1 mRNA水平大于對照組，而LPL mRNA水平則相反；隨著ASP溶液濃度的升高，未轉染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細胞活力逐漸上升。而轉染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細胞活力不變，而細胞凋亡與此相反。結論11β-HSD1是導致高脂血癥和肥胖的一個有效因素，ASP通過11β-HSD1基因片段對脂肪細胞進行調節，從而影響脂類代謝。

11β-羥基類固醇脫氫酶Ⅰ型；促酰化蛋白；肥胖；高脂血癥

肥胖癥是一種多因素導致的慢性代謝性疾病〔1〕，肥胖人群中高脂血癥的發病率達50%以上〔2〕，由此導致冠心病、高血壓、動脈硬化性血管病、2型糖尿病的發生和病死率也顯著增高。肥胖癥的脂代謝異常發生機制有很多，11β-羥基類固醇脫氫酶1型(11β-HSD1)、促酰化蛋白(ASP)參與高脂血癥的形成，但兩者在肥胖患者脂代謝中的關系尚不清楚。本文研究11β-HSD1及ASP在肥胖伴高脂血癥形成過程中的相互聯系。

1　材料與方法

1.1材料60只清潔級SD雄性大鼠，體重150～200 g，常規動物實驗室飼養，隨機分為對照組及實驗組，每組30只。人類成骨細胞3T3-L1前脂肪細胞在1∶1混合Ham′s F12的基質和Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM)培養液中培養，培養液中添加2.5 mmol/L左旋谷酰胺和 0.3 mg/ml G418 (Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)，并且添加10%小牛血清 hFOB 1.19 細胞在5% CO2，37℃溫箱中培養。

1.2方法

1.2.1造模并檢測靜脈血中脂蛋白酯酶(LPL)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平對照組給予常規普通基礎飼料，食量不低于15 g，水量不低于30 ml；實驗組除了基礎飼料外，還給予高脂高營養飼料(100 g基礎飼料中加入全脂奶15 g 、豬油5 g、雞蛋黃50 g、黃豆15 g、魚肝油10滴)喂養6～8 w，通過檢測大鼠體重并參考2010年國際糖尿病聯盟制訂的代謝綜合征全球共識要求，滿足TG、LDL，高血壓和空腹血糖(FPG)升高，確定是否造模成功。用ELISA法檢測血漿ASP(北京方程生物科技有限公司，北京)水平，自動生化分析(iChem-340全自動生化分析儀，庫倍兒，深圳)測定血漿TG、TC、LDL、VLDL、HDL水平。

1.2.2RT-PCR方法檢測各組織11β-HSD1和LPL mRNA水平造模成功后處死大鼠，并去全部大鼠的肝臟、脂肪和肌肉，液氮速凍后放入研缽，研碎，按照常規組織提取RNA的方法離心，并加入氯仿、異丙醇，反復離心，最后去白色凝膠樣沉淀，去除上清液后用DEPC-水溶液溶解，取10 μl，加入1 μl Oligo dT，水浴后再冰浴，全部參照試劑說明書操作。1β-HSD1引物：上游：5′-GCAGAGCGATTTGTTGTT-3′，下游：5′-TGTCATATGAAGCCGAGGA-3′；LPL的上游引物5′-GGACGGTGACAGFAATGTATG-3′，下游引物5′-CAGCACGATCCAGACCACTAA-3′，各引物鏈均由上海生工合成。按照PCR的反應條件和流程進行30個循環，用免疫熒光法定量檢測mRNA濃度。

1.2.311β-HSD1 siRNA設計技術通過GenBank查詢得到11β-HSD1的cDNA序列，利用WIsiRNA Selection Program提供的設計軟件，設計以11β-HSD1基因為靶標的siRNA，其中實驗組選用兩個獨立的、針對該靶基因的siRNA，設計結果為6條64 nt的寡聚核苷酸單鏈，每兩條互補，送生物技術公司合成。

1.2.4重組腺病毒11β-HSD1 siRNA載體構建技術特異性針對11β-HSD1基因的寡聚核苷酸單鏈在Tris鹽/EDTA緩沖系統(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L Nacl，pH8.0)中退火為雙鏈，在連接到BglⅡ/HindⅢ雙酶切線性化pSUPER載體上，對陽性克隆進行酶切和測序鑒定，再用EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切含siRNA表達盒子的pSUPER載體，并將其連接到同樣雙酶切的穿梭載體EH006上，然后和腺病毒輔助質粒Pjm17 共轉染HEK293進行同源重組，構建重組腺病毒11β-HSD1 RNAi表達載體。PCR鑒定，并利用終末稀釋法測定腺病毒滴度。

1.2.5細胞轉染技術將FuGENE HD轉染劑、重組質粒和無菌水放置室溫下，在六孔板中配置轉染液，每孔中吸入100 μl無菌水、2 μg重組質粒和6 μl FuGENE HD，混勻。室溫放置15 min，待六孔板中細胞80%～90%3T3-L1脂肪細胞融合時，加入上轉染液100 μl，慢速混勻30 s，培養72 h分析結果。

1.2.6Western印跡檢測11β-HSD1蛋白表達嚴格按照說明書檢測轉染后3T3-L1脂肪細胞的11β-HSD1蛋白表達情況。

1.2.7MTT檢測細胞活性將3T3-L1脂肪細胞分別放在含有0、50、100和200 mg/L ASP溶液中培養24 h,同時設空白對照組。加入20 μl終濃度為5 mg/ml的MTT，將細胞置于37℃培養4 h。之后小心移除上清，每孔加入100 μl二甲基亞砜，放置于搖床上震蕩10 min，充分溶解結晶，用移液器反復吹吸使晶體溶解。培養板放于37℃培養，溶解氣泡后，用全自動定量繪圖酶標儀(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)在570 nm波長下測定，計算公式為實驗孔A570/對照孔A570×100%。

1.2.8細胞凋亡檢測用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)分析細胞凋亡的百分率。將轉染3T3-L1的脂肪細胞放在含有0、50、100和200 mg/L ASP的溶液中培養24 h，處理后細胞在2 000 r/min離心5 min，然后用PBS洗滌2次，吸取250 μl的2×結合緩沖液和250 μl去離子水，混勻，然后將細胞懸浮于400 μl×結合緩沖液中，使濃度為1×105cells/ml，再加入5 μl Annexin V-FITC和碘化丙啶，上下顛倒混勻。處理過的細胞放于暗室進行5～15 min放射處理，然后進行流動細胞計數分析，調節流式細胞儀參數(EX=488 nm，Em=530 nm)檢測細胞凋亡情況。

1.3統計學分析采用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2　結　果

2.1兩組大鼠進食量及體重變化第1周，兩組大鼠進食量無統計學差異，1 w后實驗組大鼠進食量明顯下降，與對照比較差異顯著，實驗組食量下降一直持續到第3周。實驗組體重從第4周開始逐漸較對照增大，一直持續到第8周，組間比較差異顯著。見表1，表2。

2.2兩組大鼠收縮壓比較實驗組血壓與對照組比較無統計學差異。見表3。

2.3兩組FPG、TG、VLDL、HDL、TC、LDL水平比較實驗組FPG、TG、VLDL、HDL、TC、LDL水平高于對照組，但無顯著差異。見表4。

2.411β-HSD1 mRNA和LPL mRNA水平比較實驗組11β-HSD1 mRNA(1.19±0.14)高于對照組(0.85±0.32)；而LPL mRNA(1.2±0.22)低于對照組(1.7±0.42)(t=-3.25，P=0.00)。

2.5轉染后3T3-L1脂肪細胞的11β-HSD1蛋白表達情況轉染后3T3-L1脂肪細胞的11β-HSD1蛋白表達(0.34±0.04)遠低于未轉染組(1.54±0.11，t=0.124，P=0.000)。

2.6轉染后3T3-L1脂肪細胞和未轉染細胞用不同濃度的ASP溶液培養細胞活力的測量隨著ASP溶液濃度的升高，未轉染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細胞活力逐漸上升。而轉染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細胞活力不變(分別為41%，43%，45%和42%)。

2.7轉染后3T3-L1脂肪細胞和未轉染細胞用不同濃度的ASP溶液培養細胞凋亡的測量隨著ASP溶液濃度的升高，未轉染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細胞凋亡率逐漸下降。而轉染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細胞活力不變(分別為15%，14%，13%和14%)。

表1　大鼠不同組別進食量隨時間延長的變化

與對照組比較：1)P<0.05

表2　不同組別大鼠體重隨時間延長的變化

表3　不同組別大鼠收縮壓隨時間延長的變化

表4　不同組別大鼠在第8周血脂和血糖水平比較

3　討　論

11β-HSD1是機體中重要的糖皮質激素代謝酶，可使無活性的潑尼松轉變為有活性的氫化潑尼松，從而調節多種物質代謝。由于糖皮質激素(GC)過量所致的庫欣綜合征(CS)中表現的中心性肥胖和血脂異常與肥胖高脂血癥類似。有研究報道，CS患者內臟脂肪的分布與11β-HSD1活性增高有關〔3〕。也有研究將脂肪細胞脂肪酸結合蛋白(Ap)2前體轉至正常小鼠，使11β-HSD1在脂肪組織中特異性地過度表達，可產生肥胖及高脂血癥的表現，而給予11β-HSD1基因敲除的小鼠高脂喂養，其體重增加和血脂的上升程度明顯低于對照〔4，5〕。這些資料提示11β-HSD1可能是導致肥胖伴高脂血癥發生的重要因素。

本文發現，肥胖癥模型大鼠肝臟中11β-HSD1 mRNA水平隨著大鼠體重、血脂和血壓的升高而升高，而脂蛋白酯酶mRNA水平卻下降，從分子機制上說明11β-HSD1是導致高脂血癥和肥胖的一個有效因素；脂蛋白酯酶mRNA水平下降可能是由于高脂血癥、肥胖和內分泌調節導致脂蛋白酯酶mRNA含量降低，不能降解TG和其他脂類，所以導致肥胖癥患者血脂升高。

ASP源于脂肪細胞，由脂肪細胞分泌的三種蛋白質補體C3、因子B、因子D在補體旁路途徑中相互作用而生成。研究發現，肥胖癥、糖尿病、冠心病患者血漿ASP顯著升高〔6〕，并且對兒童肥胖癥研究發現，血漿ASP與TG呈顯著正相關〔7〕。在C3基因敲除導致ASP缺乏的小鼠模型中，餐后TG和游離脂肪酸顯著升高〔8～10〕。因此，ASP在肥胖的脂代謝紊亂中也發揮促進作用。但11β-HSD1及ASP在肥胖高脂血癥中的相互關系尚不明了。本文通過重組腺病毒11β-HSD1 siRNA載體構建技術構建了腺病毒載體，又將載體通過細胞轉染技術轉染3T3-L1脂肪細胞，隨著ASP溶液濃度的升高，未轉染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細胞活力逐漸上升，而轉染11β-HSD1 RNAi后3T3-L1脂肪細胞活力不變；細胞凋亡變化規律與細胞活性相反。因此我們認為，ASP通過11β-HSD1基因片段對脂肪細胞進行調節，從而影響脂類代謝。

1Crombie LK，Irvine L，Elliott L，etal.Targets to tackle the obesity epidemic：a review of twelve developed countries〔J〕.Public Health Nutr，2009；12(3)：406-13.

2Brown，Hin SM，Donato KA.Bodymass index and the prevalence of hypertension and dislipidemia〔J〕.Obes Res，2000；8(9)：605-19.

3Espindola AD，Kater CE.Adipose tissue expression of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 in Cushing′s syndrome and in obesity〔J〕.Arq Bras Endocrinol Metabol，2007；51(8)：1397-403.

4Masuzaki H，Paterson J，Shinyama H，etal.A transgenic model of visceral obesity and the Metabolic Syndrome〔J〕.Science，2001；294(12)：2166-70.

5Morton NM，Holmes MC，Fievet C，etal.Improved lipid and lipoprotein profile hepatic insulin sensitivity and glucose tolerance in 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 nullmice〔J〕.J Biol Chem，2001；276(13)：41293-300.

6Cianflone K，Xia Z，Chen LY.Critical review of acylation -stimulating protein physiology in human and rodents〔J〕.Biochim Tilphys Acta，2003；16(9)：127-43.

7Wamba PC，Mi J，Zhao XY，etal.Acylation stimulating protein but not complement C3 associates with metabolic syndrome components in Chinese children and adolescents〔J〕.Eur J Endocrinol，2008；159(6)：781-90.

8Xia Z，Sniderman AD，Cianflone K.Acylation-stimulating protein (ASP) deficiency induces obesity resistance and increased energy expenditure in ob/ob mice〔J〕.J Biol Chem，2002；277(17)：45874-9.

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10Katherine Cianflone，Sabin Paglialunga.Regulation of fatty acid transport and storage：influence of acylation stimulating protein〔J〕.Scand J Food Nutr，2006；50(S2)：92-8.

〔2015-11-15修回〕

(編輯徐杰)

武漢市衛生局科技課題(WX13C16)

林梅(1970-)，女，博士，主要從事糖尿病、肥胖、甲狀腺疾病研究。

吳國瓊(1975-)，女，在讀碩士，主治醫師，主要從事糖尿病、肥胖、甲狀腺疾病等研究。

R589

A

1005-9202(2016)18-4435-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.014