轉化生長因子-β1/Smad3信號通路在腎間質纖維化大鼠腎臟組織中的表達和作用

黃繼義　鐘鴻斌　彭永挑　朱戉述

(廈門市第五醫院腎內科，福建　廈門　361000)

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轉化生長因子-β1/Smad3信號通路在腎間質纖維化大鼠腎臟組織中的表達和作用

黃繼義鐘鴻斌彭永挑朱戉述

(廈門市第五醫院腎內科，福建廈門361000)

目的探討轉化生長因子(TGF)-β1/Smad3信號通路在腎間質纖維化(RIF)大鼠腎臟組織中的表達和作用。方法80只SD雄性大鼠編號，隨機平均分為單側輸尿管結扎(UUO)模型組和假手術組，UUO模型組行大鼠左側輸尿管結扎術，假手術組游離左側輸尿管但不予結扎，術后第3、7、10、14、21天時每組分別處死8只，留取大鼠左側腎臟用于病理以及蛋白測定,HE、Masson染色光鏡觀察腎臟組織形態學的改變，應用蛋白質印跡法(Western印跡)和免疫組化法(SP)檢測TGF-β1、Smad3蛋白表達，PCR檢測TGF-β1、Smad3 mRNA的表達。結果電鏡觀察結果顯示RIF大鼠建模成功，隨著結扎時間延長，UUO模型組RIF指數、Smad3與TGF-β1蛋白及mRNA表達均逐漸升高(P<0.05)，同一時間UUO模型組各指標均高于假手術組(P<0.05)。Smad3、TGF-β1與RIF指數呈正相關(r=0.564，0.735，P<0.05)，TGF-β1與Smad3間呈正相關(r=0.673，P<0.05)。結論通過檢測腎臟組織中Smad3、TGF-β1的表達可判斷RIF病情，對疾病的早期發現有重要意義。

腎間質纖維化；轉化生長因子-β1/Smad3信號通路

腎間質纖維化(RIF)是慢性腎臟疾病的共同特征，以小管基底膜成分、間質細胞外基質發生定性和定量改變、腎小管萎縮和肌纖維母細胞積聚為特征〔1〕；腎小管上皮細胞-間充質細胞轉化是RIF的重要發病機制之一〔2〕。轉化生長因子(TGF)-β1是一組新近發現的調節細胞生長和分化的TGF-β超家族，是目前發現最強的促腎纖維化信號轉導因子，可通過Smad蛋白表達實現傳導〔3〕。本文研究TGF-β1/Smad3信號通路在腎臟組織中的表達和作用。

1　資料與方法

1.1實驗動物購自廈門大學醫學院動物中心健康SD雄性大鼠80只(4～5周齡)，體重150～200 g，室溫喂養、正常飲水，飼養3 d，備用。

1.2實驗儀器和試劑石蠟切片機(德國SLEE)、PCR儀(DTC-3G型，西安天隆科技有限公司)，臺式低溫高速離心機(TGL20M-湖南湘立科學儀器有限公司)，酶標儀(Thermo熱電 Scienti)、NanoQuant PlateTM微量檢測板。-80℃冰箱、光學顯微鏡以及常見微量移液槍、槍頭等。

RIRA蛋白裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒、蛋白上清緩沖液及DAB顯色試劑盒均購自南京建成生物工程研究所、Smad3一抗(小鼠抗大鼠)和二抗(兔抗大鼠)均購自圣克魯斯生物技術公司、β-actin多克隆抗體購自南京生興生物技術有限公司，TGF-β1多抗購自Santa Cruz Biotech、SP免疫組化試劑盒(通用)購自北京北瑞達醫藥科技有限公司、磷酸鹽緩沖液(PBS)、總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、PCR試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3動物分組和建模80只SD雄性大鼠進行編號，按照隨機數字表法將其分為單側輸尿管結扎(UUO)模型組和假手術組，各40只。UUO模型組行大鼠左側輸尿管結扎術，假手術組游離左側輸尿管但不予結扎，其余手術步驟與模型組相同。

建模具體步驟：按照35 mg/kg劑量將大鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔內注射麻醉，將大鼠仰臥四肢固定鼠板上，常規手術部位備皮和消毒，取大鼠左肋下0.5 cm為切口，依次切開皮膚、肌肉、組織直到腹膜，游離輸尿管，大約在輸尿管中部夾閉結扎，完成后逐層縫合，關閉切口。術后兩組大鼠常規喂養，分別于術后第3、7、10、14、21天時每組各處死8只，留取大鼠左側腎臟用于病理以及蛋白測定，根據電鏡觀察病理纖維化程度(RIF指數)判斷建模成功與否，RIF指數>14為建模成功。

1.4腎臟組織形態學的改變取適量腎組織，常規石蠟包埋，甲醛固定，脫水，制厚切片4 μm，行HE、Masson染色，光鏡下觀察腎臟病理改變，×400倍下觀察每張切片，選擇5個不同的視野，將染色呈綠色的區域定位為纖維化陽性區域，以陽性面積/整個視野面積比值(RIF指數，取平均值作為每張切片的RIF指數)作為評價腎組織纖維化程度指標，同時觀察腎小管解離、“無腎小管的腎小球”等特征。

1.5腎組織Smad3與TGF-β1蛋白和mRNA表達腎組織Smad3蛋白：采用蛋白質印跡法(Western印跡)檢測腎組織蛋白質表達水平，取30 mg腎組織(液氮保存)，加入適量RIPA裂解液，嚴格按照說明書進行，應用BCA蛋白檢測試劑盒定量檢測蛋白總濃度，測定總蛋白濃度是否符合要求，樣品加入蛋白上樣緩沖液，取30 μg等量蛋白上樣，同時取2.5 μl Marker標志物上樣，進行SDS-PAGE電泳，電泳2 h，正常轉膜，脫脂奶粉封閉1 h，TBST緩沖液清洗4次，加入Smad3一抗，冰上過夜，繼續TBST緩沖液清洗4次，加入Smad3二抗，常溫孵育1h洗滌，暗箱中檢測電泳條帶灰度值，計算蛋白表達水平。

腎組織TGF-β1蛋白：采用免疫組化法檢測TGF-β1蛋白表達，將石蠟切片脫蠟，置于3%H2O2中室溫孵育5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，滴加PBS代替一抗，37℃孵育1～2 h，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加適量生物素標記二抗工作液，37℃孵育10～30 min，PBS沖洗，滴加適量辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10～30 min，DAB顯色，自來水充分沖洗，復染，脫水，封片。采用高倍鏡觀察切片，以棕色為陽性。腎組織Smad3和TGF-β1 mRNA：取30 mg腎臟組織，嚴格按照總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、PCR試劑盒要求步驟進行操作，提取的總RNA吸取2 μl于NanoQuant PlateTM微量檢測板上，于酶標儀波長260 nm和280 nm處檢測吸光度值(OD)，OD260/OD280在1.8～2.0為合格。引物設計(β-actin為內參)：基因β-actin，GenBank:EF095208.1，長度214 bp，引物序列正義5'GGTGGGAATGGGTCAGAAGG3'，反義5'GTTGGCCTTAGGGTTCAGGG3'；基因Smad3，GenBank:AF016189.1，長度548 bp，引物序列：正義5'AAGGCGACACATTGGGAGAG3'，反義5'ACAGGCTGGTGCCTTAGTTG3'，基因TGF-β1，GenBank:NM_011577.1，長度344 bp，引物序列正義5'GCTGAACCAAGGAGACGGAA3'，反義5'AGAAGTTGGCATGGTAGCCC3'。PCR擴增按照兩步法，95℃預變性3 min，95℃變性20 s，65℃退火20 s，72℃延伸30 s，35個循環。

1.6統計學方法應用SPSS13.0軟件，計量資料符合正態分布方差齊性的行組間t檢驗，不同天數比較采用重復測量方差分析，采用Pearson相關或者Spearman秩相關。

2　結　果

2.1腎臟組織形態學改變電鏡下觀察，術后1 w腎臟上皮細胞出現了空泡，有輕微間質水腫，術后21 d出現彌漫性炎癥細胞浸潤，各觀察時間點的RIF指數>14，說明建模均取得成功。隨著結扎時間延長，UUO模型組RIF指數逐漸升高(P<0.05)，假手術組各時間點無統計學差異(P>0.05)；同一時間UUO模型組RIF指數均高于假手術組(P<0.05)。見表1。

2.2腎組織Smad3與TGF-β1蛋白表達 隨著結扎時間延長，UUO模型組Smad3與TGF-β1蛋白表達逐漸升高(P<0.05)，假手術組無統計學差異(P>0.05)；同一時間UUO模型組蛋白表達水平均高于假手術組(P<0.05)。見表2。

2.3腎組織Smad3與TGF-β1 mRNA表達隨著結扎時間延長，UUO模型組Smad3與TGF-β1 mRNA表達逐漸升高(P<0.05)，假手術組各時間點差異無統計學意義(P>0.05)；同一時間UUO模型組Smad3、TGF-β1 mRNA表達率均高于假手術組(P<0.05)。見表3。

2.4Smad3、TGF-β1與RIF指數相關性分析UUO模型組Smad3、TGF-β1與RIF指數呈正相關(r=0.564，0.735；P<0.05)，TGF-β1與Smad3呈正相關(r=0.673，P<0.05)。

表1　兩組不同時間RIF指數

表2　兩組不同時間腎組織Smad3及TGF-β1蛋白表達比較

表3　兩組不同時間腎組織Smad3、TGF-β1 mRNA表達比較

3　討　論

RIF的發病機制是正常腎間質和腎小管結構被大量聚集的細胞外基質所代替而造成，如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白、層黏連蛋白等，細胞外基質(ECM)由成纖維細胞、腎小管上皮細胞和血管內皮細胞等細胞合成和分泌,其中成纖維細胞是沉積ECM的主要來源，在RIF中發揮著重要作用。RIF可導致腎功能損害，其治療方法主要是抑制纖維細胞活性及ECM合成，刺激ECM降解〔4〕。腎小管上皮細胞轉分化與腎臟纖維化的關系密切〔5〕，但從腎小管上皮細胞線粒體氧化損傷介導細胞死亡方面探討腎小管解離參與RIF進展機制研究較少。

Smads家族蛋白在將TGF-β信號從細胞表面受體傳導至細胞核的過程中起到關鍵性作用，不同Smad介導不同TGF-β家族成員的信號轉導〔6～8〕。TGF-β作為配體形成的受體復合物〔9〕，通過激活Smads進入核內，共同激活或抑制靶基因的轉錄〔7〕，本研究結果說明隨著結扎時間的延長，腎臟纖維化程度逐漸加重。此外，本研究還發現，隨著梗阻時間延長，TGF-β1與Smad3表達異常，推測TGF-β1與Smad3的高表達與RIF的發生、發展有關。TGF-β1與Smad3間存在協同作用，說明TGF-β1/Smad3信號通路在RIF的發生發展過程中起重要作用，這與任韞卓等〔10〕的研究結果類似。

1蘇麗娜,覃遠漢,周添標,等.轉化生長因子-β1/Smad3信號通路在腎間質纖維化大鼠腎臟組織中的表達和作用〔J〕.實用兒科臨床雜志,2011;26(5):325-8.

2崔曉影.烏司他丁對大鼠腎間質纖維化中TGF-β/Smads信號轉導通路的干預作用〔D〕.哈爾濱：哈爾濱醫科大學,2011.

3雷強.田七注射液對阿霉素腎纖維化大鼠的CTGF/TGF-β1/Smads信號通路的影響〔D〕.桂林：廣西中醫藥大學,2012.

4劉俊英.Smad2/3在大鼠腎間質纖維化中的表達及促紅細胞生成素的保護作用〔D〕.哈爾濱：哈爾濱醫科大學,2010.

5李素仙.活性維生素D3對UUO大鼠腎間質TGF-β1/Smads信號軸核酸表達的影響〔D〕.太原：山西醫科大學,2013.

6王文文.溫莪術對腎間質纖維化大鼠腎臟TGF-β1/Smad信號通路及結締組織生長因子的影響〔D〕.上海：上海中醫藥大學,2013.

5Wang Y,Lin C,Ren Q,etal.Astragaloside effect on TGF-β1,SMAD2/3,and SMA expression in the kidney tissues of diabetic KKAy mice〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2015;8(6):6828-34.

6Wang Y,Wang B,Du F,etal.Epigallocatechin-3-gallate attenuates unilateral ureteral obstruction-induced renal interstitialfibrosis inmice〔J〕.J Histochem Cytochem,2015;63(4):270-9.

7Hamzeh MT,Sridhara R,Alexander LD.Cyclic stretch-induced TGF-β1 and fibronectin expression is mediated by β1-integrin through c-Src-and STAT3-dependent pathways in renal epithelial cells〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2015;308(5):F425-36.

8Samarakoon R,Helo S,Dobberfuhl AD,etal.Loss of tumour suppressor PTEN expression in renal injury initiates SMAD3-and p53-dependent fibrotic responses〔J〕.J Pathol,2015;236(4):421-32.

9Overstreet JM,Samarakoon R,Cardona-Grau D,etal.Tumor suppressor ataxia telangiectasia mutated functions downstream of TGF-β1 in orchestrating profibrotic responses〔J〕.FASEB J,2015;29(4):1258-68.

10任韞卓,郝軍,史永紅,等.TGF-β1激活smad信號通路影響人腎小管上皮細胞增殖與凋亡〔J〕.重慶醫學,2007;36(20):2079-2081,封2,插1.

〔2015-10-23修回〕

(編輯郭菁)

廈門市科技局科技計劃惠民項目(No.3502Z20144068)

黃繼義(1963-)，男，主任醫師，主要從事腎內科疾病研究。

R693.4

A

1005-9202(2016)18-4433-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.013