全身垂直振動(dòng)對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠脛骨和子宮血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)的影響

司會(huì)群　卜淑敏　趙俊勇　文思敏　段曉麗

(首都體育學(xué)院，北京　100191)

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全身垂直振動(dòng)對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠脛骨和子宮血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)的影響

司會(huì)群1卜淑敏趙俊勇1文思敏段曉麗

(首都體育學(xué)院，北京100191)

目的探討全身垂直振動(dòng)對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠脛骨和子宮血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白表達(dá)的影響。方法采用去除大鼠雙側(cè)卵巢建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠模型。將36只3個(gè)月齡雌性健康未孕SD大鼠按體重分層后隨機(jī)分為假手術(shù)組、去卵巢靜止組和去卵巢振動(dòng)組。去卵巢10 w后，對(duì)去卵巢振動(dòng)組進(jìn)行為期7 w的全身垂直振動(dòng)訓(xùn)練。振動(dòng)結(jié)束后，用ELISA檢測(cè)血清VEGF水平，用Western印跡檢測(cè)脛骨和子宮VEGF蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果各組大鼠血清VEGF水平無(wú)顯著性差異。去卵巢靜止組大鼠子宮和脛骨近端VEGF蛋白表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，而去卵巢振動(dòng)組大鼠子宮和脛骨近端VEGF蛋白表達(dá)水平顯著高于去卵巢靜止組(P<0.05;P<0.01)。結(jié)論全身垂直振動(dòng)訓(xùn)練能上調(diào)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠子宮和脛骨近端VEGF蛋白的表達(dá)。

去卵巢大鼠；全身垂直振動(dòng)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

藥物治療雖然在一定程度上能緩解絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)的癥狀，但也會(huì)給身體其他系統(tǒng)帶來(lái)不良反應(yīng)，甚至還會(huì)出現(xiàn)不可耐受的副作用或并發(fā)癥，如藥物過(guò)敏、不正常的或大量的子宮出血、子宮內(nèi)膜增生、乳房脹痛、乳腺腫瘤等，給患者帶來(lái)極大的痛苦和不便〔1，2〕。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是預(yù)防和減緩PMOP的另一方法，并且具有明顯的優(yōu)勢(shì)。但運(yùn)動(dòng)方式的選擇很關(guān)鍵，有些運(yùn)動(dòng)對(duì)治療PMOP雖好，但易增加患者患骨關(guān)節(jié)炎、骨骼變形、骨折的危險(xiǎn)〔3〕。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，全身垂直振動(dòng)訓(xùn)練可能是一種更自然、更便捷，更安全有效的治療骨質(zhì)疏松的方式〔4,5〕，但其機(jī)制還不完全清楚。本研究觀察全身垂直振動(dòng)訓(xùn)練對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清以及子宮和脛骨近端血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)3個(gè)月齡健康雌性未孕SD大鼠36只，體重(221g±12)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)，〔動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(京)2011-0039〕。每籠飼養(yǎng)4～5只大鼠，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，飼養(yǎng)室溫度：22℃～25℃，相對(duì)濕度：50%～55%，人工控制12 h光照(7：00～19：00)，12 h黑暗(19：00～次日7：00)交替進(jìn)行。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R(減少、替代、優(yōu)化)原則給予大鼠人道的關(guān)懷。

1.2手術(shù)方法與分組適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1 w后，稱量初始體重，按體重先分層后，再隨機(jī)分為假手術(shù)組12只和去卵巢組24只。兩組大鼠均于手術(shù)前禁食12～18 h。去卵巢手術(shù)在北大醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科學(xué)部進(jìn)行，假手術(shù)組大鼠保留卵巢，只切除卵巢邊與卵巢等大的脂肪組織。大鼠手術(shù)后可以飲水，但24 h后方可進(jìn)食。各組大鼠術(shù)后靜養(yǎng)10 w，以造去卵巢骨質(zhì)疏松模型，10 w末，用雙能X線骨密度儀檢測(cè)大鼠脛骨近端在體骨密度，如去卵巢大鼠骨密度值顯著低于假手術(shù)組就說(shuō)明造模成功。將去卵巢組大鼠按體重分層，再隨機(jī)分為去卵巢靜止組(12只)和去卵巢振動(dòng)組(12只)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中去卵巢靜止組有2只大鼠相繼死亡，實(shí)驗(yàn)最后各組剩余大鼠數(shù)目分別為假手術(shù)組12只，去卵巢靜止組10只，去卵巢振動(dòng)組12只。

1.3振動(dòng)方案去卵巢后第11周，去卵巢振動(dòng)組大鼠先進(jìn)行1 w的適應(yīng)性振動(dòng)訓(xùn)練，每天2次，每次10 min，頻率50 Hz，振動(dòng)加速度3.8 g，振幅0.9 mm。從第12周開(kāi)始，進(jìn)行為期7 w的正式振動(dòng)訓(xùn)練，每天2次，每次15 min，間隔15 min，頻率90 Hz，振動(dòng)加速度3.8 g，振幅0.5 mm，正式振動(dòng)7 w，所有振動(dòng)實(shí)驗(yàn)均在上午進(jìn)行。

1.4樣品的收集末次振動(dòng)結(jié)束后24～36 h內(nèi)處死全部大鼠。術(shù)前均禁食12 h，稱量體重。先腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，后腹主動(dòng)脈取血處死，血放置4℃冰箱過(guò)夜，4℃、3 000 r/min、離心20 min，取上層血清分裝，標(biāo)注后置于-80℃冰箱用于血清VEGF檢測(cè)。取血后迅速游離子宮、按解剖位置準(zhǔn)確游離左、右后肢脛骨，將周圍附著的軟組織和肌肉剔除干凈，將子宮和右后肢脛骨近端置于液氮中凍存待測(cè)。

1.5血清VEGF水平檢測(cè)從室溫放置30 min后的鋁箔密封袋中取出實(shí)驗(yàn)所需板條，標(biāo)準(zhǔn)品孔中各加50 μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。待測(cè)樣品孔中先加10 μl待測(cè)樣品，再加40 μl樣品稀釋液。隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測(cè)樣品孔中每孔均加入50 μl辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱溫育60 min，棄去液體，在吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液后靜止1 min后再甩去，再在吸水紙上拍干，如此反復(fù)洗板5次，每孔加50 μl底物A、B，37℃避光孵育15 min，每孔再加50 μl終止液，即刻(3 min內(nèi))在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值，保留讀數(shù)結(jié)果并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

1.6Western印跡檢測(cè)子宮和脛骨VEGF蛋白表達(dá)的變化取出各組大鼠子宮和脛骨蛋白提取樣本，室溫融化后迅速上樣，在4℃冰箱中電泳2 h，起始電壓80 V，大約40 min后電壓調(diào)到120 V，電泳結(jié)束后，4℃冰箱中以電壓80 V轉(zhuǎn)膜2 h，浸入用TBS緩沖液稀釋成5%的脫脂牛奶中，室溫水平搖床封閉1 h，加1∶400稀釋的一抗，4℃冰箱孵育過(guò)夜，次日，置水平搖床上室溫繼續(xù)孵育1 h，TBS溶液洗膜4次，10 min/次，加入TBS溶液稀釋的馬抗鼠IgG/堿磷酶標(biāo)記，室溫孵育2 h，TBS溶液洗膜4次，10 min/次；BCIP/NBT顯色，蒸餾水終止顯色，利用Quantity One軟件對(duì)各蛋白條帶照片進(jìn)行掃描，記錄灰度值與β-actin灰度值之比，作為該蛋白表達(dá)的相對(duì)值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，LSD post-hoc檢驗(yàn)或Tamhane post-hoc檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1體重的變化振動(dòng)結(jié)束后，與假手術(shù)組比較，去卵巢靜止組大鼠體重顯著增加；與去卵巢靜止組比較，去卵巢振動(dòng)組大鼠體重雖沒(méi)有顯著變化，但振動(dòng)前后體重增加量顯著低于去卵巢靜止組。結(jié)果提示，全身垂直振動(dòng)訓(xùn)練能顯著抑制去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠體重的增長(zhǎng)。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠體重的變化±s,g)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與本組振動(dòng)前比較：2)P<0.05；與去卵巢靜止組比較：3)P<0.01

2.2子宮VEGF蛋白表達(dá)的變化Western印跡結(jié)果顯示，去卵巢靜止組大鼠子宮VEGF蛋白表達(dá)水平(0.828 7±0.003 6)顯著低于假手術(shù)組(0.875 4±0.001 2)，而去卵巢振動(dòng)組大鼠VEGF蛋白表達(dá)水平(0.879 9±0.004 1)顯著高于去卵巢靜止組，結(jié)果提示，全身垂直振動(dòng)訓(xùn)練能促進(jìn)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠子宮VEGF蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖1。

圖1　子宮VEGF蛋白的表達(dá)水平

2.3脛骨VEGF蛋白表達(dá)的變化Western印跡結(jié)果顯示，去卵巢靜止組大鼠VEGF蛋白表達(dá)水平(1.978 5±0.053 6)顯著低于假手術(shù)組(3.459 6±0.045 7)，而去卵巢振動(dòng)組大鼠VEGF蛋白表達(dá)水平(3.758 5±0.045 1)顯著高于去卵巢靜止組。結(jié)果提示，全身垂直振動(dòng)訓(xùn)練能促進(jìn)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠脛骨VEGF蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖2。

圖2　脛骨VEGF蛋白的表達(dá)水平

2.4血清VEGF水平的變化假手術(shù)組VEGF為(160.645 8±18.443 9)pg/ml,去卵巢靜止組為(174.499 6±33.899 4)pg/ml,去卵巢振動(dòng)組為(161.980 1±23.238 5)mg/ml。3組大鼠血清VEGF水平?jīng)]有顯著性差異，提示全身垂直振動(dòng)訓(xùn)練對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清VEGF水平無(wú)顯著影響。

3　討　論

本實(shí)驗(yàn)各組大鼠手術(shù)后造模10 w過(guò)程中，因自然生長(zhǎng)，各組大鼠體重均增加，去卵巢組增加迅速，去卵巢手術(shù)10 w時(shí)即振動(dòng)前，體重稱量結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比較，去卵巢造成體重顯著增加。與去卵巢后體重變化的相關(guān)報(bào)道〔6〕及我們實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，初步表明了去卵巢手術(shù)的成功。本文結(jié)果表明，全身垂直振動(dòng)訓(xùn)練能顯著緩解由于去除卵巢引起的大鼠體重的增加。此結(jié)果與Maddalozzo等〔7〕報(bào)道得研究結(jié)果類似。此外，本次實(shí)驗(yàn)中，去卵巢振動(dòng)組振動(dòng)訓(xùn)練后體重依然超過(guò)正常大鼠體重，出現(xiàn)此結(jié)果的可能原因之一，是全身垂直振動(dòng)對(duì)體重的抑制作用還不能完全抵消去卵巢對(duì)大鼠體重的影響，振動(dòng)后體重依然會(huì)升高，只是增長(zhǎng)的速度減緩。

VEGF是強(qiáng)有力的血管生成因子，它特異性受體相結(jié)合后，產(chǎn)生強(qiáng)大促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，引起血管加速生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，全身垂直振動(dòng)訓(xùn)練能有效扭轉(zhuǎn)大鼠因去除卵巢引起的子宮VEGF蛋白表達(dá)降低的狀況，VEGF強(qiáng)大促血管生成功能使大鼠子宮血管生長(zhǎng)加速，促進(jìn)血流和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和吸收，有利于骨質(zhì)疏松大鼠子宮功能的改善。

VEGF也是骨生長(zhǎng)因子，與骨代謝密切相關(guān)，協(xié)調(diào)著骨細(xì)胞分化、骨形成和骨吸收過(guò)程〔8,9〕，同時(shí)還在維持成骨細(xì)胞壽命中起著作用〔10〕。已有實(shí)驗(yàn)表明，血管生成在骨量轉(zhuǎn)換發(fā)生的耦聯(lián)中起到了關(guān)鍵作用〔11〕，一方面VEGF作為機(jī)體內(nèi)最強(qiáng)的血管生長(zhǎng)因子，通過(guò)血管化來(lái)參與骨的發(fā)育和形成，另一方面，VEGF也直接參與成骨和破骨的作用〔12〕，被看作骨代謝因子。多種生長(zhǎng)因子可促進(jìn)VEGF的分泌，VEGF可能是某些骨生長(zhǎng)因子發(fā)揮作用的中介。VEGF也能直接作用于成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，使局部成骨細(xì)胞數(shù)量增加，加速骨的形成，而成骨細(xì)胞也能夠產(chǎn)生旁分泌因子來(lái)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去卵巢導(dǎo)致VEGF蛋白表達(dá)降低。此結(jié)果與Kodama等〔13〕實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與李磊〔14〕報(bào)道得結(jié)果相似，說(shuō)明機(jī)械振動(dòng)不僅能增加去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠脛骨VEGF蛋白的表達(dá)，而且能促進(jìn)去卵巢骨折大鼠VEGF蛋白的表達(dá)。可見(jiàn)VEGF可能是振動(dòng)促進(jìn)骨形成的一種有效刺激信號(hào)。全身垂直振動(dòng)訓(xùn)練能上調(diào)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠子宮和脛骨近端VEGF蛋白的表達(dá)水平。

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〔2015-02-09修回〕

(編輯苑云杰/曹夢(mèng)園)

北京市市屬高等院校長(zhǎng)城學(xué)者項(xiàng)目資助(CIT&TCD20130337)

卜淑敏(1967-)，女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究。

司會(huì)群(1974-)，女，碩士，中學(xué)一級(jí)教師，主要從事運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究。

R338

A

1005-9202(2016)18-4423-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.009

1冀州市職業(yè)技術(shù)教育中心