梔子水提物和醇提物對(duì)糖尿病小鼠并發(fā)抑郁癥的防治

王君明　段佩利　師燕然　李　晴　張?jiān)略隆〈蕖＄?/p>

(河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南　鄭州　450046)

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梔子水提物和醇提物對(duì)糖尿病小鼠并發(fā)抑郁癥的防治

王君明1段佩利師燕然李晴張?jiān)略麓掮?

(河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州450046)

目的探討梔子水提物(ZZST)和80%乙醇提取物(醇提物，ZZCT)防治糖尿病并發(fā)抑郁癥的作用機(jī)制。方法雄性昆明小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性藥MH-FH〔鹽酸二甲雙胍(MH，100 mg/kg)、鹽酸氟西汀(FH，10 mg/kg)聯(lián)合用藥〕、ZZST低、中、高劑量(102、204、408 mg/kg)和ZZCT低、中、高劑量(73、146、292 mg/kg)，連續(xù)灌胃(ig)給藥21 d，1次/d，末次給藥后1 h進(jìn)行糖水消耗實(shí)驗(yàn)(SCT)、開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OFT)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(FST)和血糖測(cè)試；高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定梔子提取物中梔子苷含量。結(jié)果與正常組比較，模型組小鼠血糖水平顯著升高、糖水偏愛(ài)顯著降低、游泳不動(dòng)時(shí)間顯著增加、OFT運(yùn)動(dòng)時(shí)間和站立次數(shù)顯著降低；與模型組比較，ZZST(102、204、408 mg/kg)、ZZCT(146、292 mg/kg)和MH-FH均可使以上異常指標(biāo)顯著改善，ZZST(204、408 mg/kg)和ZZCT(292 mg/kg)均與MH-FH相比無(wú)顯著差異；ZZST和ZZCT中梔子苷含量分別為206.8 mg/g和207.1 mg/g。結(jié)論梔子提取物ZZST和ZZCT均具有防治糖尿病并發(fā)抑郁癥作用，且與陽(yáng)性藥MH-FH作用相當(dāng)；梔子苷可能為梔子防治糖尿病并發(fā)抑郁癥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

梔子；梔子苷；糖尿病；抑郁癥；糖水偏愛(ài)；強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)；開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

糖尿病并發(fā)抑郁癥是糖尿病常見(jiàn)并發(fā)癥之一，國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，糖尿病病人有60%～75%伴有抑郁情緒，其中10%～35%為重度抑郁〔1，2〕。就糖尿病而言，沉重的精神壓力、不良情緒不僅會(huì)使血糖升高、降低治療的依從性，還會(huì)加速心、腎等并發(fā)癥的發(fā)生，對(duì)預(yù)后不利。反之，血糖控制不好、病情加重又會(huì)導(dǎo)致病人精神痛苦、悲觀等，加重抑郁癥狀。重度抑郁癥還會(huì)引起悲觀和絕望，甚至出現(xiàn)自殘和自殺行為。本研究旨在考察梔子提取物防治糖尿病并發(fā)抑郁癥的作用，并比較其水提物和乙醇提取物作用的差異。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物昆明(KM)小鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔SCXK(豫)2010-0002〕。

1.1.2試藥梔子：鄭州市張仲景大藥房，產(chǎn)地江西，批號(hào)150101，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)科陳隨清教授鑒定確認(rèn)為茜草科梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實(shí)；梔子苷：上海金穗生物科技有限公司，批號(hào)：20130314，純度>98%；鹽酸二甲雙胍片：上海信宜藥廠有限公司，批號(hào)48140908；鹽酸氟西汀：常州四藥制藥有限公司，批號(hào)20130701；鏈脲佐菌素(STZ)：Sigma，批號(hào)20150225；蔗糖(分析純)：津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)2014111061；枸櫞酸(分析純)：天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150201；氫氧化鈉(分析純)：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，批號(hào)20140723；生理鹽水：河南太龍藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)13012152；血糖試紙：江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，魚(yú)躍。

1.1.3儀器高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司，e2695；UV/visible Detector：美國(guó)Waters公司，Waters2489；十萬(wàn)分之一分析天平：上海海康電子儀器廠，AB145S；色譜柱：德國(guó)邁克，C18，5 μm，250 mm×4.6 mm；血糖儀：江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，魚(yú)躍710，悅準(zhǔn)TMI型；大小鼠開(kāi)場(chǎng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：成都泰盟軟件有限公司，OFT-100；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛(ài)朗儀器有限公司，EYELA，N-1100；TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；BS210S型電子天平：北京塞多利斯天平有限公司；XK96-B快速混勻器：姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1梔子提取物制備梔子水提物(ZZST)：采用梔子飲片粗粉，每1 g梔子粗粉加6 ml水(W/V=1∶6)，回流提取2次，每次1 h，4 000 r/min離心10 min，合并離心上清液，回收水至浸膏，60℃減壓干燥，稱重，4℃保存待用。ZZST得率為20.4%。梔子醇提物(ZZCT)：采用梔子飲片粗粉，每1 g梔子粗粉加6 ml的體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇(W/V=1∶6)，回流提取2次，每次1 h，4 000 r/min離心10 min，合并離心上清液，回收乙醇至浸膏，60℃減壓干燥，稱重，4℃保存待用。ZZCT得率為14.6%。

1.2.2高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定梔子提取物中梔子苷含量

1.2.2.1色譜條件Waters e2695高效液相色譜儀，Waters 2489 紫外/可見(jiàn)光檢測(cè)器，德國(guó)邁克Reprosil-Pur Basic C18 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇：水(35∶65)，檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；柱溫：30℃；流速：1 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl。

1.2.2.2對(duì)照品溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取梓醇對(duì)照品9.47 mg，加流動(dòng)相(甲醇∶水=35∶65)制成每1 ml含947 μg的對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液(用0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為儲(chǔ)備液)，將該貯備液用流動(dòng)相等比稀釋至一系列濃度(7.4、14.8、29.6、59.2、118.4、236.8、473.5 μg/ml)的對(duì)照品溶液，儲(chǔ)備液及各稀釋液按1.2.2.1色譜條件進(jìn)樣，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，記錄相關(guān)系數(shù)r值。

1.2.2.3供試品溶液制備及含量測(cè)定分別精密稱取ZZST 20.4 mg和ZZCT 14.6 mg，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，超聲20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，精密量取上清液10 ml，用甲醇定容至25 ml，用0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，按照1.2.2.1中色譜條件進(jìn)樣，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算梔子提取物供試品中梔子苷含量。梔子苷含量以mg/g提取物計(jì)。

1.2.3動(dòng)物處理及血糖測(cè)試用0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH 4.2)配制STZ注射液，小鼠在禁食16 h后(不禁水)一次性腹腔注射(ip) STZ (150 mg/kg)造糖尿病模型〔3〕；造模后小鼠經(jīng)過(guò)72 h的自由飲食后，于尾靜脈取血，用血糖儀測(cè)定血糖值(血糖>11.1 mmol/L為糖尿病模型制作成功)，篩選血糖值>11.1 mmol/L的小鼠再予慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(CUMS)〔4〕，每天隨機(jī)給予一種應(yīng)激，CUMS主要包括夾尾3 min(距尾尖1 cm)、禁水24 h(8：00～8：00)、潮濕飼養(yǎng)24 h(將200 ml水加入有鋸末的籠底，24 h)、禁食24 h(8：00～8：00)、束縛(5 min)、搖晃(1次/s，15 min)和冷水(8℃)游泳7 min；陽(yáng)性藥(MH-FH)采用鹽酸二甲雙胍(MH，100 mg/kg)和鹽酸氟西汀(FH，10 mg/kg)聯(lián)合用藥(ig給藥)，受試ZZST低、中、高劑量(102、204、408 mg/kg，分別相當(dāng)于梔子原藥材臨床等效劑量的1、2、4倍劑量)和ZZCT低、中、高劑量(73、146、292 mg/kg，分別相當(dāng)于梔子原藥材臨床等效劑量的1、2、4倍劑量)，模型組和正常組僅ig給予等量溶媒(0.5%CMC-Na)，其中正常組不給予造模而模型組造模，兩組均不給予受試藥物。每天CUMS的同時(shí)，給予各受試藥物或溶媒，連續(xù)21 d，末次給藥后1 h進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，立即尾靜脈取血，測(cè)試血糖值。陽(yáng)性藥及各受試藥物均用0.5% CMC-Na溶解或混懸至所需給藥濃度。

1.2.4糖水消耗試驗(yàn)(SCT)小鼠于實(shí)驗(yàn)前24 h訓(xùn)練適應(yīng)含糖飲水，在禁食禁水12 h后進(jìn)行SCT。測(cè)試時(shí)，所有小鼠單籠飼養(yǎng)，在安靜的房間進(jìn)行，每籠即每只小鼠放兩個(gè)水瓶(內(nèi)分別裝入清水和1%蔗糖水，體積均為100 ml，兩水瓶位置隨機(jī)放置)，2 h后取走水瓶并測(cè)量體積(測(cè)試前后瓶中水量之差)，測(cè)定2 h內(nèi)小鼠1%蔗糖水?dāng)z入體積及清水?dāng)z入體積，按公式計(jì)算每只動(dòng)物的糖水偏愛(ài)。糖水偏愛(ài)=〔糖水?dāng)z入體積/(糖水?dāng)z入體積+清水?dāng)z入體積)×100%〕。

1.2.5開(kāi)場(chǎng)試驗(yàn)(OFT)采用大小鼠開(kāi)場(chǎng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)OFT-100進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠放入中心方格內(nèi)，記錄小鼠在5 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)距離和站立次數(shù)。

1.2.6強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(FST)〔5〕將小鼠單獨(dú)放入高20 cm、直徑14 cm的圓柱形玻璃缸中，缸內(nèi)水深10 cm，水溫(25±2)℃，從小鼠入水后計(jì)時(shí)6 min，記錄后4 min內(nèi)游泳累計(jì)不動(dòng)時(shí)間(指小鼠在水中停止掙扎，或顯示漂浮狀態(tài)，僅有微小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.5軟件，多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較用LSD法。

2　結(jié)　果

2.1梔子提取物中梔子苷含量測(cè)定結(jié)果實(shí)驗(yàn)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=14 054x-7 597.1，其中x指梔子苷濃度(μg/ml)，y指峰面積，相關(guān)系數(shù)r=1，線性范圍為0.074～4.735 μg；含量測(cè)定結(jié)果顯示，ZZST中梔子苷含量為206.8 mg/g提取物，ZZCT中梓醇含量為207.1 mg/g提取物。

2.2梔子提取物對(duì)各組小鼠血糖的影響與正常組比較，模型組小鼠空腹血糖水平顯著升高(P<0.01)，表明STZ造糖尿病模型成功。與模型組比較，在給予受試藥物3 w后，ZZST(102、204、408 mg/kg)、ZZCT(146、292 mg/kg)和陽(yáng)性藥MH-FH均可使高血糖小鼠血糖水平顯著降低(P<0.05)，且ZZST和ZZCT與MH-FH相比均無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3梔子提取物對(duì)各組小鼠糖水偏愛(ài)的影響與正常組比較，模型組小鼠糖水偏愛(ài)顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，在給予受試藥物3 w后，ZZST(102、204、408 mg/kg)、ZZCT(146、292 mg/kg)和陽(yáng)性藥MH-FH均可使高血糖小鼠糖水偏愛(ài)顯著升高(P<0.05)，且ZZST和ZZCT與MH-FH相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.4梔子提取物對(duì)各組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的影響與正常組比較，模型組小鼠FST游泳不動(dòng)時(shí)間顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，在給予受試藥物3 w后，ZZST(102、204、408 mg/kg)、ZZCT(146、292 mg/kg)和陽(yáng)性藥MH-FH均可使小鼠FST不動(dòng)時(shí)間顯著降低(P<0.05或P<0.01)，且ZZST和ZZCT與MH-FH相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.5梔子提取物對(duì)各組小鼠OFT中運(yùn)動(dòng)時(shí)間和站立次數(shù)的影響與正常組比較，模型組小鼠在OFT運(yùn)動(dòng)時(shí)間和站立次數(shù)均顯著降低(均P<0.01)。與模型組比較，在給予受試藥物3 w后，ZZST(204、408 mg/kg)、ZZCT(146、292 mg/kg)和陽(yáng)性藥MH-FH均可使小鼠OFT運(yùn)動(dòng)時(shí)間和站立次數(shù)顯著升高(P<0.05)，且ZZST和ZZCT與MH-FH相比無(wú)明顯差異(P>0.05)；此外，ZZST低劑量(102 mg/kg)亦可顯著升高小鼠OFT的站立次數(shù)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1　梔子提取物對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥小鼠血糖、糖水偏愛(ài)、FST不動(dòng)時(shí)間的影響

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

表2　梔子提取物對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥小鼠OFT運(yùn)動(dòng)時(shí)間和站立次數(shù)的影響

3　討　論

糖尿病引發(fā)的高血糖使機(jī)體器官和組織代謝紊亂，甚至?xí)奂爸袠猩窠?jīng)系統(tǒng)，誘發(fā)精神癥狀出現(xiàn)。糖尿病患者飲食受限、生活質(zhì)量下降更易引發(fā)抑郁等負(fù)面情緒，終而導(dǎo)致糖尿病并發(fā)抑郁癥。再者，抑郁癥患者缺乏運(yùn)動(dòng)且飲食不規(guī)律，服藥依從性差，更加不利于糖尿病的治療。二者之間的相互影響，加大了糖尿病抑郁癥的治療難度。

梔子具有清心除煩和清三焦郁火之良效，具有降糖解郁理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果已表明，梔子提取物具有降糖〔6〕和抗抑郁作用〔7〕。本研究結(jié)果顯示，STZ引起了小鼠血糖顯著升高，進(jìn)一步通過(guò)CUMS引起了小鼠的抑郁樣行為，如糖水偏愛(ài)降低(反映抑郁癥的核心癥狀——興趣缺乏和快感缺失)、游泳不動(dòng)時(shí)間增加(反映抑郁癥主要癥狀——行為絕望)、OFT運(yùn)動(dòng)時(shí)間(反映水平活動(dòng)能力)和站立次數(shù)(反映垂直活動(dòng)能力)降低(反映抑郁癥主要癥狀——情緒低落)等，綜合提示小鼠糖尿病抑郁癥模型復(fù)制成功；給予ZZST、ZZCT和陽(yáng)性藥MH-FH 3 w后，過(guò)高血糖被顯著降低、糖水偏愛(ài)顯著升高、游泳不動(dòng)時(shí)間顯著減少、OFT運(yùn)動(dòng)時(shí)間和站立次數(shù)均顯著升高，且ZZST和ZZCT與MH-FH各指標(biāo)相比均無(wú)明顯差異，綜合提示ZZST和ZZCT均具有防治糖尿病并發(fā)抑郁癥的作用，且與MH-FH作用相當(dāng)。

依據(jù)梔子苷含量測(cè)定結(jié)果，如果將梔子提取物的劑量折合至對(duì)應(yīng)梔子苷的劑量，那么ZZST的劑量102、204和408 mg/kg分別相當(dāng)于梔子苷的劑量為21、42和84 mg/kg；同樣，ZZCT的劑量73、146和292 mg/kg分別相當(dāng)于梔子苷的劑量為15、30和60 mg/kg。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)中ZZST和ZZCT的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果不難看出，作用強(qiáng)弱與梔子苷絕對(duì)量(折合劑量)的多少呈現(xiàn)明顯正相關(guān)。如糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，ZZST低、中、高劑量(102、204和408 mg/kg)均明顯提高了高血糖小鼠的糖水偏愛(ài)且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系，一定程度上，可以認(rèn)為隨著梔子苷絕對(duì)量的增加，對(duì)糖水偏愛(ài)的升高作用增加；同樣的分析結(jié)果亦可在本研究的其他幾個(gè)實(shí)驗(yàn)中得到印證。因此，梔子苷可能為梔子防治糖尿病并發(fā)抑郁癥的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

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4王亞軍，張瑜，田永萍，等.針?biāo)幗Y(jié)合治療對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠行為學(xué)的影響〔J〕.中醫(yī)研究，2008；21(11)：12-5.

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〔2016-01-04修回〕

(編輯袁左鳴)

The effects of extracts from water and ethanol of Gardenia jasminoides Ellis on diabetes complicated with depression

WANG Jun-Ming,DUAN Pei-Li,SHI Yan-Ran,et al.

Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment & Chinese Medicine Development of Henan Province,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450046,Henan,China

ObjectiveTo investigate the effects of extracts from water and ethanol of Gardenia jasminoides Ellis(GJ) on diabetes complicated with depression.MethodsMale mice were divided into normal,model control,MH-FH as positive control,low,middle and high doses of water extract of GJ (ZZST),and low,middle and high doses of 80% ethanol extract of GJ (ZZCT).Mice were treated with MH-FH,ZZST,ZZCT or solvent 0.5% CMC-Na everyday for 21 continuous days by intragastric administration (ig).Mouse sugar consumption test (SCT),forced swim test (FST),open field test (OFT) and blood glucose test (BGT) were used to observe the preventive effects on diabetes complicated by depression of ZZST and ZZCT,respectively,at 1 h after the last administration.Besides,high performance liquid chromatography (HPLC) was used to measure the contents of geniposide in ZZST and ZZCT.ResultsCompared with those of normal group,blood sugar and immobility time of FST were significantly increased,and sucrose preference,moving time and standing times were all significantly decreased.Compared with those of model group,above abnormal parameters were all significantly ameliorated by ZZST,ZZCT and MH-FH.The contents of geniposide in ZZST and ZZCT were 206.8 and 207.1 mg/g,respectively.ConclusionsZZST and ZZCT exert preventive effects on diabetes complicated with depression equal to MH-FH.Geniposide might be one of the main bioactive compounds of GJ in prevention on diabetes complicated with depression.

Gardenia jasminoides Ellis;Geniposide;Diabetes;Depression;Sucrose preference;Forced swim test;Open field test

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81503269)；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃項(xiàng)目(2014GGJS-072)；鄭州市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(20150309)；河南中醫(yī)學(xué)院省屬高校基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2014KYYWF-QN01)

王君明(1980-)，男，博士，博士后，副教授，主要從事中藥藥性藥效作用機(jī)理及新藥研發(fā)。

R28

A

1005-9202(2016)18-4410-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.003

1河南中醫(yī)藥大學(xué)呼吸病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心