高效液相色譜法測定氣血寧口服液中阿魏酸含量＊

林曉春，翁立冬，鄭錦坤，李旭桂，黃升昌，林曉佳

（1.廣東省粵北人民醫院，廣東韶關512026;2.南方醫科大學，廣東廣州510515）

高效液相色譜法測定氣血寧口服液中阿魏酸含量＊

林曉春1，翁立冬2，鄭錦坤1，李旭桂1，黃升昌1，林曉佳2

（1.廣東省粵北人民醫院，廣東韶關512026;2.南方醫科大學，廣東廣州510515）

目的建立測定氣血寧口服液中阿魏酸含量的高效液相色譜(HPLC)法。方法色譜柱采用Kromasil HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（17∶83），流速為1.0 mL/min，檢測波長為316 nm，柱溫為20℃。結果阿魏酸進樣量在0.02～0.10 μg范圍內與峰面積呈現良好的線性關系(r=0.999 9);平均加樣回收率為99.64%，RSD為1.04%(n=6);阿魏酸含量檢測平均結果為0.014 4 g/L。結論該法操作簡便、結果準確、重復性良好，可作為氣血寧口服液中阿魏酸含量控制方法。

氣血寧口服液;高效液相色譜法;阿魏酸;含量測定

氣血寧口服液原名八珍口服液，由黨參、熟地黃、白術（炒）、茯苓、當歸、白芍、川芎、益母草、甘草等9味藥材組方，是廣東省食品藥品監督管理局批準的醫療機構制劑(粵藥制字Z20071531)，有著20多年的臨床實踐基礎。該制劑是粵北人民醫院特色醫院制劑，能調補氣血，臨床用于由氣弱血虧引起的形容憔悴、四肢倦怠及婦女月經不調、痛經等［1-2］。氣血寧口服液是在古方“八珍湯”基礎上按中醫藥傳統理論調配，方中當歸甘、辛、溫，歸肝、心、脾經，功能補血活血、調經止痛、潤腸通便［3］;川芎辛、溫，歸肝、膽、心包經，功能活血行氣、祛風止痛［4］。阿魏酸是當歸、川芎的主要活性成分之一，具有多種藥理作用，如抗炎、止痛、抗血栓形成、擴張微血管、防止血壓升高等［5-6］。前期研究中，以高效液相色譜(HPLC)法測定芍藥苷含量和甘草、白術的薄層鑒別作為質量控制的指標［7-8］。本試驗中采用HPLC法測定氣血寧口服液中阿魏酸的含量，以完善制劑的質量控制指標。現報道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器

1260型高效液相色譜儀(Agilent科技有限公司); Cp225D型電子天平(德國賽多利斯公司);1810D型自動雙重純水蒸餾器(上海申生科技有限公司)。

1.2試藥

氣血寧口服液(批號為20120201，20120716，20121126，20130423，20130608，20131031，20131230，20140227，由粵北人民醫院制劑室提供);阿魏酸對照品(批號為110773-201313，中國食品藥品檢定研究院);乙腈(色譜純，德國默克公司)，乙酸乙酯、乙醚、石油醚、甲醇、乙醇、磷酸等均為分析純(天津市福晨化學試劑廠)，水為雙蒸水。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱:Kromasil HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;檢測波長:316 nm;流速:1.0 mL/min;流動相:乙腈-0.1%磷酸溶液（17∶83）;柱溫:20℃;進樣量: 10 μL。按阿魏酸峰計算，理論板數應不低于5 000。

2.2溶液制備

2.2.1供試品溶液

精密量取氣血寧口服液4 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.2.2對照品溶液

取適量阿魏酸對照品，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得質量濃度為0.02 g/L芍藥苷對照品溶液。

2.2.3陰性對照品溶液

按氣血寧口服液處方中藥材比例，稱取當歸、川芎以外的處方藥材并按生產工藝制備缺當歸、川芎的陰性樣品，按2.2.1項方法，制備缺當歸、川芎的陰性對照品溶液。

2.3方法學考察

專屬性試驗:按擬訂色譜條件，取阿魏酸對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10 μL進樣。結果阿魏酸對照品溶液與供試品溶液色譜相應的位置上有相同保留時間的色譜峰，而陰性對照品溶液在此保留時間無對應色譜峰。色譜圖見圖1。

圖1　高效液相色譜圖

線性關系考察:按擬訂色譜條件，取阿魏酸對照品溶液1，2，3，4，5 μL，分別進樣測定并記錄相應峰面積。以阿魏酸進樣量（m，μg)為橫坐標、相應的峰面積（S）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程S=13 563m+0.83 (r=0.9999)。結果表明，阿魏酸進樣量在0.02～0.10 μg范圍內與峰面積有良好的線性關系。

精密度試驗:精密吸取同一阿魏酸對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣10 μL，測定阿魏酸峰面積，重復進樣6次。結果見表1，阿魏酸峰面積的RSD為0.76% (n=6)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗:精密吸取同一供試品溶液（批號為20131230）4.0 mL，按擬訂色譜條件，于0，6，12，18，24 h時分別進樣10 μL測定。結果見表2，阿魏酸峰面積的RSD為1.13%(n=5)，表明24 h內供試品溶液穩定性良好。

表1　精密度試驗結果(n=6)

表2　穩定性試驗結果(n=6)

重復性試驗:取同一批樣品（批號為20131230）6份，各4.0 mL，按供試品溶液的制備方法制備。按擬訂色譜條件，測定樣品中阿魏酸的峰面積并計算相應的阿魏酸含量。結果見表3，阿魏酸含量的RSD為0.97%(n=6)，表明該方法重復性良好。

表3　重復性試驗結果(n=6)

加樣回收試驗:精密量取樣品（含量為0.021 5 g/L，批號為20131230）2 mL，分別置10 mL容量瓶中，精密加入阿魏酸對照品溶液(含阿魏酸0.04 mg)2 mL，并按供試品溶液制備方法制備溶液，按擬訂色譜條件測定阿魏酸含量。結果見表4。

表4　加樣回收試驗結果(n=6)

2.4樣品含量測定

取樣品8批，按供試品溶液的制備方法，按擬訂色譜條件測定溶液中阿魏酸含量。結果見表5。

表5　各批樣品中阿魏酸含量測定結果

3　討論

3.1流動相選擇

阿魏酸為酚酸類化合物，為更好地與其他成分分離，流動相一般需增加酸性成分，以避免分離時產生的峰拖尾現象。當歸中阿魏酸含量測定時，采用乙腈-0.085%磷酸溶液［9］或者乙腈-0.1%冰醋酸溶液［10］作為流動相，在兩種流動相條件下，色譜峰分離度均達不到要求且拖尾峰嚴重。故增加流動相中磷酸溶液的酸性（0.1%磷酸溶液），流動相為磷酸-乙腈(83∶17)時，色譜峰的分離度和峰對稱因子均符合規定。

3.2檢測波長選擇

2010年版《中國藥典(一部)》當歸項中阿魏酸含量測定波長采用316 nm［11］。本試驗中，在200～400 nm波長范圍內掃描阿魏酸對照品溶液，結果阿魏酸對照品在316nm處有最大吸收峰，故選擇316nm作為檢測波長。

3.3提取溶劑和提取方法選擇

阿魏酸在熱水、乙醇、甲醇、乙醚、乙酸乙酯中均有較好的溶解性，故供試品溶液中阿魏酸的提取方法可采用直接稀釋法或者萃取法［12-13］，其中熱水、乙醇、甲醇為稀釋劑，乙醚、乙酸乙酯、石油醚為萃取劑。本試驗中，比較了6種不同溶劑、兩種不同提取方法對阿魏酸提取率的影響。結果采用稀釋劑水、乙醇、甲醇的阿魏酸含量分別為0.021 2，0.0209，0.0211 g/L，萃取劑為乙酸乙酯、乙醚、石油醚測得的阿魏酸含量分別為0.020 1，0.011 2，0.001 3 g/L，表明采用直接稀釋法測得的阿魏酸含量較高。同時，以水為稀釋劑的圖譜色譜峰分離度較差，故采用甲醇為稀釋溶劑，直接稀釋法測定供試品中阿魏酸的含量。

3.4陰性樣品選擇

本品處方組成中含有當歸和川芎，兩者皆含有阿魏酸［14］，測定含量時，可同時檢測;制備陰性樣品時，可制成缺當歸、川芎雙陰性樣品。

3.5阿魏酸含量標準設定

處方中含阿魏酸的以當歸、川芎為主，本試驗中，以氣血寧口服液中阿魏酸含量限度作為制劑質量控制的指標。結果8批樣品平均含量為0.019 6 g/L，RSD為0.21%。阿魏酸不穩定，遇到光和熱容易分解，其含量相對較低;同時考慮含量限度的制訂與藥材批次間含量差異，檢測允許的誤差范圍;參照中藥含量限度的有關資料［15-16］，阿魏酸含量設定相對較寬，根據實測結果，將含量限度定為1 mL含阿魏酸不得少于8 μg。

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Content Determination of Ferulic Acid in Qixuening Oral Liquid by HPLC

Lin Xiaochun1，Weng Lidong2，Zheng Jinkun1，Li Xugui1，Huang Shengchang1，Lin Xiaojia2
（1.Yubei People's Hospital，Shaoguan，Guangdong，China512026；2.Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China510515）

ObjectiveTo establish an HPLC method for the content determination of ferulic acid in Qixuening Oral Liquid.Methods The Kromasil HC-C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）was used，acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution（17∶83）was used as the mobile phase，the low rate was 1.0 mL/min and detected at a wavelength of 230 nm，and the temperature was 20℃.Results The content of ferulic acid was linear in the range of 0.02-0.10 μg（r=0.999 9），the average recovery was 99.64%and RSD was 1.04%(n=6).The average results of ferulic acid content were 0.014 4 g/L.ConclusionThis method is simple，quick and accurate，and can be used for the content determination of ferulic acid in Qixuening Oral Liquid.

Qixuening Oral Liquid；HPLC；ferulic acid；content determination

R284.1;R286.0

A

1006-4931（2016）13-0071-03

林曉春(1984-)，男，碩士研究生，藥師，研究方向為醫院藥學，(電子信箱)xiaochunll@ 163.com。

2016-01-20;

2016-03-31）

＊廣東省建設中醫藥強省科研課題，項目編號:20142143;廣東醫院藥學研究基金，項目編號:2015A32;廣東省韶關市科學計劃，項目編號:2014CX/K204;廣東省韶關市醫學科研基金，項目編號:Y14064。