羅漢松實(shí)多糖含量測(cè)定方法研究＊

龐逸敏，林彩琴，潘嬌紅，蔣偉哲，黃增瓊

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530021）

羅漢松實(shí)多糖含量測(cè)定方法研究＊

龐逸敏，林彩琴，潘嬌紅，蔣偉哲，黃增瓊

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530021）

目的建立測(cè)定羅漢松實(shí)多糖含量的紫外分光光度法。方法采用超聲輔助提取法提取多糖，以葡萄糖為對(duì)照品，采用硫酸-苯酚比色法測(cè)定羅漢松實(shí)中多糖的含量，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm。結(jié)果葡萄糖質(zhì)量濃度在20～100 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.008 0 X-0.015 8，r=0.998 0(n=5），平均回收率為101.64%，RSD為4.77%(n=6)。羅漢松實(shí)多糖平均含量為4.74 mg/g(以葡萄糖計(jì))。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于羅漢松實(shí)多糖含量的測(cè)定。

羅漢松;多糖;含量測(cè)定;超聲輔助提取

羅漢松實(shí)為羅漢松科植物羅漢松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don的果實(shí)，又名土杉，產(chǎn)自我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)，目前在我國(guó)有4個(gè)變種，多為庭園觀賞樹，在廣西北海已有較大規(guī)模種植，每年可產(chǎn)出大量的羅漢松果實(shí)。羅漢松果實(shí)由種子和花托組成，其花托部分可當(dāng)作水果直接食用，具有補(bǔ)腎益肺、治血虛面色萎黃和心胃痛的功效［1］。種子有補(bǔ)中益氣、祛風(fēng)除濕的功效，根皮能活血、止痛、殺蟲［2］;葉子能止血，可用于咳血、吐血［1］。Park等［3-5］從羅漢松葉中分離得到了羅漢松內(nèi)酯和羅漢松二萜等十幾種成分。目前，對(duì)羅漢松葉的化學(xué)成分研究報(bào)道較多，但羅漢松果實(shí)的研究國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。多糖作為一類重要的生物大分子物質(zhì)，具有抗癌、抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等生物活性［6-7］。筆者采用超聲輔助提取法［8］對(duì)羅漢松實(shí)中的多糖進(jìn)行了提取，并采用Dubois等［9］提出的硫酸-苯酚比色法測(cè)定了羅漢松實(shí)多糖的含量，為羅漢松果實(shí)的藥效學(xué)研究及開發(fā)利用提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器

1.2試藥

羅漢松實(shí)鮮品采自廣西北海，經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室朱丹博士鑒定，為羅漢松科植物羅漢松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don的果實(shí)。葡萄糖對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110833-201205);無水乙醇、95%乙醇、苯酚、濃硫酸及其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液制備

2.1.15%苯酚試劑

準(zhǔn)確稱取苯酚5.0 g，加水溶解，置100 mL棕色容量瓶中定容，得5%苯酚試劑，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液

精確稱取干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品0.100 0 g，加水溶解，置100 mL容量瓶定容，配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的葡萄糖溶液，精密量取10 mL，定容至100 mL，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液［10］。

2.1.3供試品溶液

面對(duì)自貿(mào)園區(qū)可能給自由貿(mào)易協(xié)定帶來的貿(mào)易偏移等消極影響，大部分自由貿(mào)易協(xié)定采取了將自貿(mào)園區(qū)法律制度納入其規(guī)則體系的應(yīng)對(duì)措施。具體而言，自由貿(mào)易協(xié)定應(yīng)對(duì)自貿(mào)園區(qū)挑戰(zhàn)的根本方法是不再承認(rèn)自貿(mào)園區(qū)貨物可同時(shí)疊加享有自由貿(mào)易協(xié)定的減免稅收待遇，從而將自貿(mào)園區(qū)貨物與區(qū)域貿(mào)易貨物拉回到相近的競(jìng)爭(zhēng)“起跑線”。通常，自由貿(mào)易協(xié)定會(huì)限制或禁止自貿(mào)園區(qū)貨物以免稅的方式流通進(jìn)自由貿(mào)易協(xié)定成員國(guó)，自貿(mào)園區(qū)貨物需要在出口市場(chǎng)繳納相應(yīng)的進(jìn)口稅，或不承認(rèn)自貿(mào)園區(qū)給予非區(qū)域進(jìn)口零件或裝備所享受的國(guó)內(nèi)稅收優(yōu)惠。但各個(gè)自由貿(mào)易協(xié)定采取的方式及審查標(biāo)準(zhǔn)并不相同。

粗多糖的提取:準(zhǔn)確稱取羅漢松實(shí)100 g，加120 mL無水乙醇回流1 h，趁熱濾除溶劑，重復(fù)2次。濾渣用95%乙醇潤(rùn)洗3次，每次20 mL，加水400 mL，超聲(功率60%，300 W)提取30 min，80℃水浴再提取60 min，趁熱過濾。重復(fù)提取2次，合并濾液并濃縮至10 mL。濃縮液加4倍量無水乙醇，置4℃冰箱中過夜后3 000 r/min離心20 min，沉淀物用無水乙醇、丙酮洗滌至無色，得粗多糖［11］。

Sevage法脫蛋白［12］:粗多糖加40 mL蒸餾水溶解，加入Sevage試劑正丁醇∶氯仿（1∶5，V/V），震蕩30 min，5 000 r/min離心15 min，收集多糖溶液并定容至100 mL容量瓶中，得供試品溶液。

2.2測(cè)定波長(zhǎng)選擇

精密吸取供試品溶液1.0 mL，置具塞試管，加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，快速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置5 min，30℃水浴中保溫20 min，靜置10 min，以蒸餾水同法操作為空白，于460～510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，確定最大吸收波長(zhǎng)為490 nm。

2.3方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制［13］:分別精密量取質(zhì)量濃度為0.1 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置具塞試管，分別加水至1 mL，各加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻。快速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置5 min，30℃水浴中保溫20 min，靜置10 min，以1.0 mL蒸餾水加入1 mL苯酚和5 mL濃硫酸為空白，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、吸光度(Y)為縱坐標(biāo)制繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y= 0.008 0X-0.015 8，r=0.998 0（n=5)。結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在20～100 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

精密度試驗(yàn):精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，按2.1.3項(xiàng)下方法操作，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，平行測(cè)定6次。結(jié)果的RSD為0.21%(n=6)，表明儀器精密度良好。

顯色穩(wěn)定性試驗(yàn):精密量取供試品溶液2 mL，按2.1.3項(xiàng)下方法操作，490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，分別于0，30，60，90，120，150，180 min時(shí)測(cè)定吸光度。結(jié)果的RSD為1.25%(n=7)，表明供試品溶液在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):精密量取供試品溶液6份，每份1 mL，按2.1.3項(xiàng)下方法操作。結(jié)果吸光度的RSD為3.31% (n=6)，表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗(yàn):精密量取已知質(zhì)量濃度的羅漢松實(shí)多糖溶液0.5 mL，分別加入質(zhì)量濃度為0.1 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25 mL及蒸餾水0.25 mL，按2.1.3項(xiàng)下方法操作，平行測(cè)定6次，測(cè)定吸光度并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4樣品含量測(cè)定

取羅漢松實(shí)2份，按2.1.3項(xiàng)下方法操作，精密量取供試品溶液1 mL，依法測(cè)定吸光度，每份測(cè)定3次，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡萄糖的質(zhì)量濃度。含量計(jì)算公式為:多糖含量(mg/g)=CDV/W，其中C為樣品中葡萄糖質(zhì)量濃度(g/L)，D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)，V為多糖溶液的體積(mL)，W為樣品質(zhì)量(g)。結(jié)果羅漢松實(shí)多糖平均含量為4.74 mg/g(以葡萄糖計(jì))，RSD為2.73%。結(jié)果見表2。

表2　樣品多糖含量測(cè)定結(jié)果

3　討論

多糖含量的測(cè)定方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、地衣酚-硫酸法、Somogyi-Nelon法等多種方法。本試驗(yàn)是利用多糖在濃硫酸作用下，水解生成單糖，并迅速脫水生成羥甲基糠醛，羥甲基糠醛與苯酚縮合成有色化合物，該化合物顏色深淺與糖的濃度成正比。方法簡(jiǎn)便，且供試液在3 h內(nèi)顯色穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好，但要注意除去單糖、醇溶性蛋白等干擾性成分。

本試驗(yàn)中，在進(jìn)行多糖樣品提取時(shí)，先用無水乙醇回流除去脂溶性成分和色素，再用Sevage法除去蛋白，可排除樣品中雜質(zhì)的干擾。采用蒸餾水對(duì)花托中的色素進(jìn)行提取并進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)色素于490 nm波長(zhǎng)處無吸收，可排除色素對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。

采用本法測(cè)定羅漢松實(shí)鮮品多糖含量時(shí)，要將花托充分搗爛，否則所測(cè)得含量結(jié)果偏差較大。

本試驗(yàn)以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，用紫外分光光度法測(cè)定羅漢松實(shí)中多糖含量，得出羅漢松實(shí)多糖的含量為4.74 mg/g(以葡萄糖計(jì))。該方法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可測(cè)定羅漢松實(shí)多糖的含量，為羅漢松實(shí)的質(zhì)量控制和資源開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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Content Determination of Podocarpus Macrophyllus

Pang Yimin，Lin Caiqin，Pan Jiaohong，Jiang Weizhe，Huang Zengqiong
（College of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi，China533021）

ObjectiveTo determine the polysaccharides content of fruit from Podocarpus macrophyllus.MethodsThe ultrasonic-assisted extraction method was used to extract polysaccharides from the fruit ofPodocarpus macrophyllus and the polysaccharides content was determined by sulphuric acid-phenol colorimetric method，with glucose as

ubstance.The UV detection wavelength was 490 nm.ResultsGlucose absorbance showed a good linear relationship with the content in the range of 20-100 μg/mL.The regression equation is Y=0.008 0 X-0.0158，r=0.998 0（n=5），and the average recovery rate was 101.64%，RSD=4.77%（n=6）.The average content of polysaccharides inPodocarpus macrophyllus is 4.74 mg/g（according to glucose）.ConclusionThis determination method is simple to be operated，with good reproducibility，and the results are accurate and reliable，which can be used to determine the polysaccharides content of Podocarpus macrophyllus.

Podocarpus macrophyllus；polysaccharides；content determination；ultrasonic-assisted extraction

R284.1;R282.71

A

1006-4931（2016）13-0022-03

龐逸敏（1991-），女，漢族，廣西玉林人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯窠?jīng)藥理學(xué)，(電子信箱) PYMPYMPYM1219@163.com;黃增瓊（1979-），壯族，廣西南寧人，博士研究生，副教授，研究方向?yàn)橹兴幟褡逖芯颗c開發(fā)，本文通訊作者，（電話）0771-5352512。

2016-01-10;

2016-02-07）

＊廣西南校中青年教師基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào):KY2016YB096;廣西南寧市生物制藥產(chǎn)業(yè)大型科學(xué)儀器與設(shè)備共享與服務(wù)平臺(tái)建設(shè)—廣西醫(yī)科大學(xué)共享平臺(tái)建設(shè)，項(xiàng)目編號(hào):20121052-1。