不同方法提取黃野螟性信息素粗提物組分GC-MS分析

張勝男，沈婧，牟靜，秦文權，羅晶，張錦坤，溫秀軍

（華南農業大學林學院，廣東廣州　510642）

不同方法提取黃野螟性信息素粗提物組分GC-MS分析

張勝男，沈婧，牟靜，秦文權，羅晶，張錦坤，溫秀軍

（華南農業大學林學院，廣東廣州510642）

黃野螟（Heortia vitessoides Moore）是一種嚴重危害珍貴樹種土沉香（Aquilaria sinensis）的食葉害蟲。該研究采用吸附法、溶劑提取法、腺體直接進樣法等3種方法獲得性信息素的粗提物，通過氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）進行分析。結果顯示：吸附法的粗提物有87個物質峰，性信息素疑似物2種，分別為Z8-12:OH和E8，E10-12:OH；溶劑提取法的粗提物有163個物質峰，性信息素疑似物2種，分別為Z8-12:OH和Z7-12:Ac；腺體直接進樣法沒有從其樣本分析出黃野螟性信息素的疑似成分。試驗比較了不同方法之間的差異，研究結果可為黃野螟性信息素組分提取分析提供參考。

黃野螟；性信息素；提取方法

黃野螟（Heortia vitessoides Moore）屬鱗翅目（Lepidoptera）螟蛾科（Pyralidae），是我國土沉香（Aquilaria sinensis）種植區發生的重要食葉害蟲[1]。國內主要分布于廣東、云南、福建、廣西、海南、臺灣、香港等地；國外廣泛分布在印度、尼泊爾、斯里蘭卡、斐濟等國家[2]。它以幼蟲咬食土沉香葉片危害，由于蟲口密度大，生長速度快，大發生時常把葉片吃光，造成土沉香光禿無葉，嚴重影響植株的健康生長[3]。近年來，隨著土沉香的大面積推廣種植，黃野螟的危害日益嚴重。

傳統的化學防治易導致黃野螟產生抗藥性，應用昆蟲性信息素監測害蟲發生和防治，具有用量少、靈敏度高、專一性強、對環境友好等特點，已得到世界各地普遍認可[4]。目前，對于黃野螟的研究多側重于生物學特性及發生規律[1]、雌雄蛹鑒定[5]、幼蟲頭部感器掃描觀察[6]、植物源揮發物對黃野螟驅避引誘作用[7]和化學藥劑防治黃野螟等[8-9]，本實驗通過對黃野螟性信息素粗提物提取方法進行分析比較，找出最適宜的提取方法。為測定黃野螟性信息素奠定基礎。

1　材料與方法

1.1供試蟲源

試驗所需黃野螟成蟲采自于廣州市白云區太和鎮繆屋土沉香樹上黃野螟幼蟲，于2015年9～10月在實驗室（25依1）益、D：L=8頤16、濕度75%依5%的人工智能氣候條件下飼養，以寄主植物土沉香葉片飼喂，化蛹羽化后所得。

1.2主要儀器

氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）（agilent，7890A）。

1.3黃野螟性信息素粗提物的采集方法

1.3.1吸附法

取吸附片（MonoTrap，日本GL Sciences，直徑1cm，厚0.3mm）置于有機玻璃制成的容器內（17cm伊18cm伊40cm），容器內放50頭處女雌蛾，12h后取出第1批，放入同樣數量相同齡期的第2批處女雌蛾，在（25依1）益條件下共吸附24h，將吸附片置于含有400滋L重蒸二氯甲烷的解析瓶內，超聲波解析5min后，馬上進行性信息素成分測定或置于-20益的冰箱內保存備用。

1.3.2溶劑提取法

將黃野螟剛羽化的雌蟲放入人工氣候箱內［溫度（25依1）益、濕度75%依5%、暗期09：00-17：00）］飼養，待其2日齡并進入暗期2～4h時取出，為方便操作，在-20益冰箱內冷凍5min后，用拇指與食指輕壓蟲體腹部，擠出腹部腺體，用眼科手術剪剪取腺體，按每腺體10滋L重蒸正己烷浸泡。浸泡液在25益條件下，置于人工搖床上，搖晃50min后，用醫用一次性注射器吸取浸泡液，過濾后，移置色譜瓶內，氮氣（流速為200mL/min）濃縮10倍后，馬上進行性信息素成分測定或置于-20益的冰箱內保存備用。

1.3.3腺體直接進樣法

將2日齡暗化3h的黃野螟處女雌蛾，在-20益冷凍5min后，食指與拇指輕壓蟲體腹部，迫使其伸出腺體，用眼科手術剪刀剪取腺體，將腺體置于一特殊玻璃小管內，每小管放3個腺體。然后放置于GC-MS一特制的熱分離進樣桿內，腺體直接氣化進入GC-MS進行性信息素成分分析。

1.4黃野螟雌蟲性信息素成分的分析

對經觸角定位儀測定確認含有性信息素成分的粗提物或處于釋放性信息素的腺體進行GC-MS分析，并參考已知鱗翅目昆蟲性信息素成分，初步確認黃野螟雌蟲性信息素的活性成分。

GC-MS設置。分析條件：柱子型號：DB-5毛細柱（非極性柱，30m伊250滋m伊0.25滋m）。升溫程序：40益保持3min，然后每分鐘上升6益到270益，保持3min，進樣口溫度260益。載氣為氦氣。溶劑延遲5min。采集模式：全掃描，火焰離子化檢測器（FID）檢測。無分流進樣，界面溫度250益，離子源溫度230益。MS四極桿150益，增益系數1.00，載氣為He，流量為1mL/min。EI電子轟擊，檢測器電壓350V，發射電流150滋A。采集速度0.6s/次，原子質量單位采集質量范圍40～330amu，開始采集時間3min。采用Windows NT/Xcalibur軟件進行數據的采集和分析。

（1）反復潤洗進樣針數次后，吸取1滋L重蒸正己烷進樣。

（2）結果顯示雜質峰較少時，吸取1滋L樣品進樣分析；化合物通過NIST和Willey質譜庫鑒定。

2　結果分析

2.1吸附法

對吸附法提取的性信息素粗提物進行GC-MS分析，得到總離子流圖（圖1）。用GC-MS分析軟件在總離子流圖上自動積分，得到87個可識別的物質峰。昆蟲性信息素在結構上有較大的相似性，多數為長鏈不飽和醇、醋酸脂、醛或酮類，鏈長一般為10～18碳，碳鏈長度為C12、C14、C16的約占目前已知昆蟲性信息素總數的90%，這些化合物的分子量范圍分布在158～308之間[10]。在質譜庫中對每個物質峰進行檢索，參照已知鱗翅目昆蟲性信息素成分，得到2種黃野螟性信息素疑似組分[11]，見表1。將GC-MS分析給出的表1中的2種化合物質譜圖與譜庫中的標樣質譜圖進行對比（圖2、圖3）進一步確定這2種物質名稱。

圖1　吸附法的黃野螟性信息素粗提物成分的總離子流

表1　吸附法的性信息素粗提物可能含有的性信息素組分

圖2　Z8-12:OH質譜圖與質譜庫標樣質譜圖對比

圖3　E8，E10-12:OH質譜圖與質譜庫標樣質譜圖對比

2.2溶劑提取法

用重蒸正己烷提取的黃野螟性信息素粗提物進行GC-MS分析得到總離子流圖，如圖4所示。通過用GC-MS分析軟件在總離子流圖上自動積分后，得到可識別物質峰163個，在質譜庫中對每個物質峰進行檢索，參照已知鱗翅目昆蟲性信息素成分，得到2種可能是黃野螟性信息素組分，見表2。將GC-MS分析給出的這2種質譜圖與譜庫中的標樣質譜圖進行對比（圖5、圖6）進一步確定這2種物質名稱。該方法提取是浸泡大量處女雌蛾腺體，所以其粗提物中性信息素物質含量較大，這在總離子流圖上相應顯示了峰較大面積。

圖4　溶劑提取法的黃野螟性信息素粗提物成分的總離子流

表2　溶劑提取法的粗提物可能含有的黃野螟性信息素組分

圖5　Z8-12:OH質譜圖與質譜庫標樣質譜圖對比

圖6　Z7-12:Ac質譜圖與質譜庫標樣質譜圖對比

2.3腺體直接進樣法將3個正處于釋放性信息素的黃野螟處女雌蛾腺體直接放入GC-MS分析得到總離子流圖（圖7），通過用GC-MS分析軟件在總離子流圖上自動積分后，得到可識別物質峰151個，對比質譜庫檢索，并結合對比質譜圖，未發現不飽和醇、醋酸脂、醛或酮類物質。此方法操作相對容易，所需的試驗材料相對較少，但在暗化處理時，在短時間內無法保證測試所需數量的雌成蟲都是處于求偶狀態，而每次分析僅能采用較少的腺體數量，這會導致樣本內沒有性信息素成分或含量極低，容易導致儀器無法分析出供試昆蟲的性信息素成分。

圖7　黃野螟腺體成分的總離子流

3　結論與討論

3.1黃野螟性信息素的采集方法

黃野螟性信息素提取采用吸附法、溶劑提取法和腺體直接進樣法，分別對吸附法與腺體直接分析法以及吸附法與溶劑提取法GC-MS結果對比分析（圖8、圖9）。前2種方法的樣本經GC-MS分析后各找到2種引發雄蛾觸角有電生理反應的物質，其中1種物質在2種方法中均有發現。腺體直接進樣法沒有從其樣本分析出黃野螟性信息素的疑似成分。溶劑提取法所采集的黃野螟性信息素樣本經GC-MS分析，得出163個可識別物質峰；吸附法得出87個可識別物質峰。前者所含的雜質種類較多，GC-MS出峰較為復雜，物質峰分析的工作量大，但其物質峰較大，含量較多，又有助于物質識別分析；后者所含的雜質較少，物質峰分離好，有助于儀器分析和識別，分析時工作量較小，且樣品中的物質成分與性信息素釋放成分比例較為接近，有利于人工模擬配制其性引誘劑；但由于吸附材料的性質不同，難以吸附到全部的性信息素組分。此外，溶劑提取法需要較多的供試昆蟲樣本，而吸附法所需樣本較少。從2種提取法所得到黃野螟不同性信息素組分來看，這2種方法對比各有優缺點，互補性強。目前已研究出的昆蟲性信息素物質主要分為：不飽和醇、醋酸酯、醛或酮類物質[12]。一般昆蟲的性信息素組分包括2種或2種以上物質，一種提取方法很難同時將同一種昆蟲的性信息素組分全部提取到。所以在昆蟲的性信息素研究中，為了更好地收集昆蟲性信息素成分，建議采用2種提取方法。

圖8　吸附法與腺體直接分析法GC-MS分析結果

圖9　吸附法與溶劑提取法GC-MS分析結果

3.2黃野螟雌蟲性信息素成分的分析

該研究對信息素粗提物進行GC-MS分析，參照已知鱗翅目昆蟲的性信息素成分，從GC-MS分析出的性信息素粗提物成分中找出可能的性信息素成分。利用性信息素的3種提取方法進行GC-MS分析得到3種黃野螟性信息素疑似成分，其中溶劑提取法獲得的性信息素疑似成分2種，分別為Z8-12：OH和Z7-12：Ac，比例為1：4；吸附法獲得的性信息素疑似成分2種，分別為Z8-12：OH和E8，E10-12：OH，比例為1.6：0.6。其中二者共有1種物質Z8-12：OH。腺體直接進樣法沒有檢測到黃野螟性信息素疑似成分。綜上所述，3種方法發現黃野螟性信息素疑似組分有3種化合物，分別為E8，E10-12：OH、Z7-12：Ac和Z8-12：OH，其中E8，E10-12：OH也是蘋果蠹蛾的性信息素成分[13]。今后還需使用GC-EAD技術對黃野螟性信息素粗提物進行分析，盡可能找出其性信息素組分，同時驗證黃野螟性信息素疑似組分的合理性。最后還需進行林間引誘試驗，以確認等于或超過活雌蛾及其粗提物誘蟲效果的性信息素組分和配比。

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Extraction of Female Adult Sex Pheromone Gland From Heortia vitessoides Moore Using Different Isolation Methods and Identification of Its Compounds by GC-MS

ZHANG Sheng-nan,SHEN Jing,MOU Jing,QIN Wen-quan,LUO Jing,ZHANG Jin-kun,WEN Xiu-jun
（College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642）

Heortia vitessoides Moore is the most serious pest of Aquilaria sinensis.The research adopted the adsorption method,solvent extraction and glands direct sampling method to obtain the extract from female adult sex pheromone gland. The chemical compositions of the extract were analyzed by GC-MS.The results showed that adsorption method had 87 peak and found two compounds might be the sex pheromone,respectively Z8-12:OH and E8,E10-12:OH;the solvent extraction原method had 163 peak and found two compounds might be the sex pheromone,respectively Z8-12:OH and Z7-12:Ac,but none compound have been found in glands direct sampling method.We compared the difference between different methods. In addition,this study lays a foundation for the insect sex pheromone of Heortia vitessoides Moore.

Heortia vitessoides Moore;Sex pheromone;Extract methods

F433.4

A

1002-3356（2016）03-0001-04

2016-05-11

張勝男（1992-），女，碩士，研究方向：化學生態學和森林昆蟲學。E-mail：2268339633@qq.com。

溫秀軍（1965-），男，博士，教授，研究方向：森林昆蟲學。