分子熒光法快速測定飼料中的金霉素

高向陽，高遒竹，張小燕，楊朋飛

（1.鄭州科技學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，河南鄭州450064；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450002）

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檢測分析

分子熒光法快速測定飼料中的金霉素

高向陽1，3*，高遒竹2，張小燕1，楊朋飛1

（1.鄭州科技學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，河南鄭州450064；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450002）

為快速測定飼料中金霉素含量，將實驗樣品采用超聲波浸提后，用分子熒光法快速測定。結(jié)果表明，鹽酸金霉素的最佳分析條件為：激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長421 nm，轉(zhuǎn)化時間60 min，轉(zhuǎn)化溫度40℃，pH 11.50，超聲溫度60℃，超聲功率160 W，料液比1∶50。工作曲線的回歸方程為Y=798.32X+21.208，相關(guān)系數(shù)r=0.9996，檢出限為0.544 ng/mL，定量限1.813 ng/mL；樣品加標(biāo)回收率為92.00%～103.83%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于1%（n=11）。

金霉素；超聲提取；堿性轉(zhuǎn)化；分子熒光；飼料

金霉素可對多種病原菌起抑制作用，具有防治細(xì)菌性腸炎、萎縮性鼻炎和痢疾等作用（彭義杰等，2014；施杏芬等，2004）。人類長期食用含有抗生素的肉類或禽蛋后可在體內(nèi)蓄積，會產(chǎn)生較強(qiáng)的毒副作用和耐藥菌，導(dǎo)致抗生素藥物效果變差或失效，致使病菌乘虛而入，嚴(yán)重者可造成死亡。此外，如果飼料中添加金霉素，則隨畜禽糞便污染土壤和河流，嚴(yán)重威脅環(huán)境和食品安全。因此，建立快速、靈敏測定飼料中金霉素的方法，對食品安全檢測、環(huán)境保護(hù)和人體健康，均有積極的現(xiàn)實意義。

目前，抗生素的測定方法主要有高效液相色譜法、紫外-可見分光光度法、毛細(xì)管電泳法、免疫分析法、薄層色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、化學(xué)發(fā)光法等（羅輝泰等，2015；張澤英，2013；李周敏等，2012）。分子熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、簡便快速的優(yōu)點(diǎn)。本實驗采用超聲輔助浸提方法浸提樣品，建立了堿性介質(zhì)中用分子熒光法測定飼料中金霉素的新方法。

1　材料與方法

1.1材料與試劑肉雞飼料（浙江東立綠源飼料有限公司）；大豬復(fù)合預(yù)混料（鄭州鼎盛飼料有限公司）；高檔豬用濃縮飼料（鄭州市嘉吉飼料有限公司）；肉用仔雞中期配合飼料（鄭州市興發(fā)飼料有限公司）；仔豬配合飼料（鄭州正大飼料有限公司）；高檔豬用復(fù)合預(yù)混料（鄭州市成農(nóng)飼料有限公司）。

100μg/mL鹽酸金霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司生產(chǎn)，批號：201412）；1.20 μg/mL pH 11.50鹽酸金霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：取100 μg/mL鹽酸金霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.20 mL于100 mL容量瓶，調(diào)節(jié)pH為11.50后，用pH 11.50的氫氧化鈉溶液定容。

碳酸氫鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（天津市德恩化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司）。所用玻璃器皿在質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%硝酸中浸泡6 h投入使用；所用水為二次重蒸水。

1.2儀器與設(shè)備970CRT熒光分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；雷磁PXSJ-216離子計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SYZ-135石英亞沸高純水蒸餾器（金壇市杰瑞爾電器有限公司）。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用1.20 μg/mL pH 11.50的鹽酸金霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成0.00、0.06、0.12、0.24、0.48、1.20 μg/mL的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，45℃恒溫1 h，冷至室溫，以350 nm波長激發(fā)，421 nm波長測定相對熒光強(qiáng)度，同時做空白實驗。以濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2樣品中金霉素含量的測定稱取0.30 g（準(zhǔn)至0.0001 g）樣品于25 mL容量瓶中，以料液比為1∶50的量加入pH 11.50的氫氧化鈉溶液，160 W功率、60℃水浴超聲30 min，冷至室溫，用pH 11.50的氫氧化鈉溶液定容、混勻，吸取上層液于離心管中，3000 r/min離心3 min，上清液在與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的條件下測定。按下式計算樣品中金霉素的含量，同時進(jìn)行空白實驗。

式中：ω為樣品中金霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；25為樣品定容體積，mL；478.88為金霉素的相對分子量；798.32為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；515.34為鹽酸金霉素的相對分子量；m為取樣量，g。

2　結(jié)果與分析

2.1最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長的確定取1.20 μg/mL的鹽酸金霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，固定發(fā)射波長為421 nm，激發(fā)光在200～800 nm掃描，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，鹽酸金霉素的最佳激發(fā)光波長為350 nm。

圖1　鹽酸金霉素激發(fā)光譜

固定激發(fā)波長為350 nm，熒光發(fā)射光譜在200～800nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果如圖2所示。

圖2　鹽酸金霉素發(fā)射光譜

由圖2可知，鹽酸金霉素的最佳發(fā)射光波長為421 nm。

2.2鹽酸金霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.2.1酸度的影響吸取1.20 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.00 mL于6個小燒杯中，分別調(diào)節(jié)其pH為7、8、9、10、11、12后，定量轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，50℃水浴鍋中轉(zhuǎn)化30 min，冷卻至室溫，分別用對應(yīng)pH的氫氧化鈉溶液定容，在完全相同的條件下測定其相對熒光值。結(jié)果表明同一濃度的鹽酸金霉素溶液pH為11時熒光值最大。

2.2.2轉(zhuǎn)化時間的選擇準(zhǔn)確量取1.20 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.00 mL于5個小燒杯中，調(diào)節(jié)pH為11，于45℃恒溫水浴鍋中分別轉(zhuǎn)化20、40、60、80、120 min，冷卻至室溫后定量轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，用pH 11的氫氧化鈉溶液定容。在完全相同的條件下測定其相對熒光值，結(jié)果表明最佳轉(zhuǎn)化時間為60 min。

2.2.3轉(zhuǎn)化溫度的選擇準(zhǔn)確量取1.20 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.00 mL于7個小燒杯中，調(diào)節(jié)pH為11，分別在30、40、50、60、70、80、90℃的恒溫水浴鍋中轉(zhuǎn)化30min，冷卻至室溫后定量轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，分別測定其相對熒光值，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化溫度取40℃較為合適。

2.2.4正交實驗在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別設(shè)置轉(zhuǎn)化pH為10.50、11.00、11.50三個水平；轉(zhuǎn)化時間55、60、65 min三個水平；轉(zhuǎn)化溫度35、40、45℃三個水平。采用L9（33）正交實驗對標(biāo)準(zhǔn)溶液轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表1所示。

表1　正交實驗設(shè)計結(jié)果

由表1可知，各因素影響轉(zhuǎn)化效果的大小順序為C＞A＞B，即轉(zhuǎn)化時間＞溫度＞pH，最佳轉(zhuǎn)化條件組合為A2B3C2，即溫度40℃、pH 11.50、時間60 min下測定的相對熒光值靈敏度最高。

2.3工作曲線與相關(guān)系數(shù)按1.3.1方法繪制工作曲線，結(jié)果如圖3所示。

圖3　鹽酸金霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖3可知，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性方程為：Y=798.32X+21.208，R2=0.9992，相關(guān)系數(shù)r=0.9996。鹽酸金霉素為0.006～1.20 μg/mL時與相對熒光值呈良好線性關(guān)系。

2.4超聲功率的選擇設(shè)定超聲功率為80～200 W進(jìn)行研究，結(jié)果表明功率為160 W時熒光值達(dá)到最大。

2.5超聲溫度的選擇準(zhǔn)確稱取肉用仔雞中期配合飼料各0.5000 g于6個25.00 mL容量瓶中，用pH為11.50的氫氧化鈉溶液定容。分別在30、 40、50、60、70、80℃水浴中提取30 min。3000 r/min離心3 min后取上清液測定，結(jié)果表明超聲溫度60℃測定信號達(dá)到峰值。

2.6料液比的選擇準(zhǔn)確稱取肉用仔雞中期配合飼料各1.0000 g于7個100 mL容量瓶中，設(shè)定料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，加入pH為11.50的氫氧化鈉溶液，50℃水浴超聲提取30 min，3000 r/min離心3 min后取上清液測定，結(jié)果表明料液比選擇為1∶40時，金霉素相對熒光值最大。

2.7超聲提取條件的正交實驗優(yōu)化為優(yōu)化最佳提取條件，在單因素實驗基礎(chǔ)上，取肉用仔雞中期配合飼料0.4000 g，選擇超聲溫度、超聲功率及料液比做L9（33）正交實驗，結(jié)果如表2所示。

表2　超聲提取正交實驗結(jié)果

由表2可知，影響金霉素提取效率的各因素大小順序為C＞A＞B，即料液比＞超聲功率＞水浴溫度。最佳組合為A2B2C3，即在超聲功率為160 W、60℃及料液比為1∶50時樣品提取效率最高。

2.8回收率按實驗方法操作，并添加標(biāo)準(zhǔn)金霉素溶液進(jìn)行回收率實驗，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，樣品加標(biāo)回收率實驗結(jié)果較為理想。

2.9檢出限和定量限對空白樣進(jìn)行11次平行測定，按3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計算的檢出限為0.544 ng/mL，按10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計算的定量限為1.813 ng/mL。

表3　回收率測定結(jié)果

2.10樣品測定結(jié)果及精密度對樣品進(jìn)行11次平行測定，檢驗無可疑值后，取平均值報告，結(jié)果如表4所示。

表4　樣品測定結(jié)果

參照農(nóng)業(yè)部《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》（農(nóng)業(yè)部公告第168號，2001）對豬飼料及雞飼料金霉素含量的規(guī)定。各飼料樣品中金霉素含量均未超過規(guī)定值，平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜1%。

3　結(jié)論

研究結(jié)果表明，鹽酸金霉素溶液的pH為11.50，40℃下轉(zhuǎn)化60 min為最佳轉(zhuǎn)化條件；超聲提取功率為160 W，溫度為60℃，料液比為1∶50時飼料樣品中金霉素的提取效果最佳；標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=798.32X+21.208，相關(guān)系數(shù)r=0.9996，檢出限為0.544 ng/mL，定量限為1.813 ng/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜1%，加標(biāo)回收率結(jié)果令人滿意。所測定飼料樣品本底中均含有金霉素，但未超過國家規(guī)定值。該法操作簡單，省試劑、快速方便、精密度高，100 min左右可完成6個樣品的測定，適用于批量飼料樣品中金霉素的日常快速檢測，有一定科學(xué)參考價值和推廣應(yīng)用價值。

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In order to develop the rapid determination of chlortetracycline content in feed，the samples were determined by molecular fluorescence spectrometry after extraction with ultrasonic technology.The results showed that the optimal excitation wavelength was 350 nm for chlortetracycline hydrochloride，emission wavelength was 421 nm，the conversion time was 60 min，transformation temperature was 40℃，pH was 11.50，ultrasonic temperature was 60℃，ultrasonic power was 160 W and the material liquid ratio was 1∶50.The regression equation of work curve was Y=798.32+21.208X，the linear correlation coefficient（r）equalled 0.9996，detection limit was 0.544 ng/mL，quantitative limit was 1.813 ng/mL.The standard addition recovery rate was between 92.00%and 103.83%，and relative standard deviation（RSD）was less than 1%（n=11）.

chlortetracycline；ultrasonic extraction；alkaline conversion；molecular fluorescence；feed

S816.17

A

1004-3314（2016）05-0029-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160507

鄭州市科技局新興產(chǎn)業(yè)研究與開發(fā)基金資助（153PXXCY186）