降鈣素對兔膝骨性關節炎關節軟骨的保護作用及機制

尤笑迎　楊紅梅

(鄭州人民醫院骨科,河南　鄭州　450003)

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降鈣素對兔膝骨性關節炎關節軟骨的保護作用及機制

尤笑迎楊紅梅1

(鄭州人民醫院骨科,河南鄭州450003)

目的探討降鈣素(CT)對膝骨性關節炎(KOA)關節軟骨的保護作用及機制。方法36只健康大耳白兔隨機分為假手術組(sham組)、CT治療組(CT組)和生理鹽水處理組(NS組),CT組和NS組采用改良Hulth法制備KOA模型，sham組以同樣術式進入關節腔但不做其他處理。術后第6周開始CT組每天皮下注射CT 5 U/kg，sham組和NS組給與等量生理鹽水皮下注射，連續4 w。觀察KOA發病過程軟骨形態變化、酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測血清和關節液白細胞介素(IL)-1β、免疫組化法檢測關節軟骨Ⅱ型膠原和基質金屬蛋白酶(MMP)-1的變化、TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡情況。結果NS組關節軟骨損傷嚴重，Mankin評分明顯高于sham組，血清及關節液IL-1β含量明顯升高(P<0.05)，關節軟骨Ⅱ型膠原含量明顯降低，MMP-1活性和軟骨細胞凋亡百分數明顯升高(P<0.05)；而CT治療組關節軟骨損傷較NS組減輕、IL-1含量、MMP-1活性和軟骨細胞凋亡百分數明顯降低(P<0.05)，Ⅱ型膠原含量明顯升高。結論CT可能通過抑制IL-1β分泌，恢復軟骨基質的合成與降解平衡，減少軟骨細胞凋亡，對關節軟骨具有一定的保護作用，從而延緩關節軟骨退變過程。

膝骨性關節炎；白細胞介素-1；降鈣素；細胞凋亡

骨性關節炎(OA)是臨床常見的退行性關節疾病,多發生于負重大、活動多的關節,以膝關節最常受累。 據世界衛生組織的調查〔1〕，OA發病人口已達10%左右，其發病率和年齡呈現正相關，年齡≥60歲時發病率50%左右，而≥75歲發病率可達80%，是導致中老年患者關節疼痛和致殘的首要原因〔2〕,目前認為OA 的發生發展是多因素參與的復雜過程，包括遺傳傾向、年齡、炎性細胞因子、自由基、性激素、創傷、軟骨細胞過度凋亡等，其中炎性細胞因子特別是白細胞介素(IL)-1β〔3〕和軟骨細胞過度凋亡〔4〕與老年 OA的關系密切。OA缺乏早期有效的治療手段，給家庭和社會帶來了嚴重負擔，因此，目前迫切需求明確OA 的發病機制，從而有效預防和降低OA 的發生。研究發現，降鈣素(CT)可通過與破骨細胞表面的CT受體結合抑制骨吸收，同時還可直接作用于軟骨細胞促進骨小梁組織及骨基質成分合成，而延緩OA的病理進程〔5,6〕。本研究旨在觀察CT對兔膝骨性關節炎(KOA)模型關節軟骨的保護作用，同時檢測OA發生過程中IL-1β的表達及軟骨細胞的凋亡情況，探討其可能的作用機制。

1　材料和方法

1.1材料36只大耳白兔(普通級，購自河南省實驗動物中心)，4～6月齡，體質量2.5～3.0 kg，雌雄不限。鮭魚CT注射液為北京諾華制藥有限公司產品。Ⅱ型膠原、基質金屬蛋白酶(MMP)-1免疫組化試劑盒，酶聯免疫吸附(ELISA)及TUNEL檢測試劑盒分別購自武漢博士德生物制劑有限公司和上海銳聰科技發展有限公司。

1.2方法

1.2.1動物分組36只大耳白兔適應性喂養1 w后,隨機分為假手術組(sham組)、CT治療組(CT組)和生理鹽水處理組(NS組)，每組12只。CT組和NS組采用改良Hulth法〔7〕制備KOA模型，sham組以同樣術式切開關節腔但不做其他處理。

1.2.2術后處理術后分籠飼養，每日肌肉注射青霉素20 萬U，連續1 w以預防感染。1 w后每天強迫活動1 h，連續4 w。術后第6周CT組行降鈣素5 U/kg每天皮下注射，連續4 w，sham組和NS組給予等量生理鹽水皮下注射。

1.2.3標本采集及處理9 w后經耳緣靜脈空氣栓塞處死動物，1 ml生理鹽水沖洗關節腔，收集關節液；同時心臟取血5 ml，37.0℃水浴45 min。關節液及血樣本3 000 r/min離心30 min，取上清液，-20℃保存，待檢。

1.2.4IL-1β含量檢測采用ELISA雙抗夾心法檢測血清、關節滑液中的IL-1β含量，按試劑盒說明書進行，酶標儀L450 nm處測OD值。

1.2.5關節軟骨病理變化觀察實驗結束打開關節腔，觀察術側膝關節關節囊、滑膜、關節軟骨及關節液情況，同時取股骨內髁關節軟骨，固定、脫鈣、包埋、切片，用于HE和免疫組織化學染色。軟骨組織形態變化參照Mankin改良的關節軟骨病理評分標準〔8〕進行積分統計。

1.2.6軟骨組織Ⅱ型膠原、MMP-1蛋白表達情況檢測Ⅱ型膠原、MMP-1蛋白檢測采用免疫組織化學染色法進行，按試劑盒說明書進行，HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像分析系統(同濟千屏)測定陽性細胞的灰度值，取每張切片均值作為測量值。

1.2.7軟骨細胞凋亡情況檢測采用TUNEL法檢測軟骨細胞的凋亡情況，按試劑盒說明書進行。每張切片隨機選取5個不重疊高倍視野，計算陽性細胞百分數。

2　結　果

2.1大體觀察術后3～5 d膝關節腫脹較明顯，后肢力量減低，活動減少，1 w后逐漸好轉，sham組可自由活動，CT和NS組動物膝關節不穩，有異常活動，9 w內膝關節感染2只，被淘汰，列入觀察的共34只，sham組11只，NS組11只，CT組12只。sham組滑膜無明顯增生，關節液清亮透明，關節面平整光滑，呈藍白色；NS組滑膜出現不同程度的增生粘連，關節液混濁呈泡沫狀，關節面粗糙，呈灰黃色；CT組可見滑膜輕度增生，關節液略增多，關節面色澤變淡，光澤度降低。見圖1。

2.2軟骨組織形態學觀察正常關節軟骨分為表淺層、移行層、放射層和鈣化層。sham組關節軟骨面平滑規整，軟骨細胞多，排列整齊，基質均勻、粉紅色，軟骨細胞核呈深藍色，軟骨層次及潮線清晰可辨；NS組軟骨表層變薄，出現裂隙，有軟骨細胞簇集現象，潮線多不完整或消失；CT組軟骨表面較規則、裂隙少，軟骨結構可辨，潮線尚完整，見圖2，Mankin評分見表1。

圖1　各組動物左下肢的大體形態觀察

圖2　各組關節軟骨形態學觀察結果(HE，×200)

2.3血清及關節液IL-1β含量sham組血清及關節液IL-1β吸光度值明顯低于NS和CT組，而NS組又明顯高于CT組(P<0.05)，見表1。

2.4軟骨組織Ⅱ型膠原、MMP-1蛋白表達情況sham組軟骨基質Ⅱ型膠原主要分布于表層和中層，均勻深染，吸光度值高于NS和CT組；NS組Ⅱ型膠原染色淡，表層有脫色現象；CT組軟骨基質Ⅱ型膠原染色良好，主要分布于表層及中層，細胞簇周圍出現深染，吸光度值高于NS組(P<0.05)，見表1 。NS組軟骨全層可見呈棕黃色表達的MMP-1，sham組僅表層軟骨細胞內偶見MMP-1弱陽性表達，CT組陽性表達介于前二者之間。

表1　各組關節軟骨Mankin評分及Ⅱ型膠原、MMP-1及IL-1吸光值變化

與sham組比較:1)P<0.05；與NS組比較:2)P<0.05

2.5軟骨細胞凋亡情況見圖3。NS組軟骨全層可見大量凋亡的軟骨細胞，細胞凋亡細胞百分數為(29.65±2.03)%，sham組偶見凋亡的軟骨細胞，細胞凋亡細胞百分數為(4.12±0.37)%，CT組軟骨細胞凋亡情況(8.32±1.62)%介于前兩者之間，組間比較差異顯著(P<0.05)。

圖3　各組關節軟骨細胞凋亡情況(TUNEL法，×200)

3　討　論

OA以軟骨進行性退變、軟骨下骨變性、骨贅形成及滑膜炎性改變為主要病理特征〔9〕,其發生機制尚未完全闡明，目前研究認為炎性細胞因子特別是IL-1β和細胞凋亡在OA的病理過程中發揮重要作用〔3,4,10〕。IL-1是炎癥反應的始動因素和重要調節因子,由巨噬細胞、軟骨細胞和滑膜細胞產生,有IL-1α和IL-1β兩種亞型，膝關節液中以IL-1β為主,正常情況下滑膜細胞產生微量的IL-1β，KOA時滑膜組織和軟骨細胞可通過自分泌作用合成大量的IL-lβ，IL-1β反過來又可刺激滑膜增生和破壞軟骨組織，形成惡性循環，IL-1β量與OA嚴重程度呈正相關〔11〕。軟骨細胞膜上分布有IL-1β 的受體，高水平的IL-1β與其受體結合干擾軟骨細胞的正常代謝和功能，一方面促進MMP-1和MMP-3表達，加快軟骨基質的降解〔12,13〕； 另一方面IL-1β還可通過兩種方式參與軟骨細胞凋亡:一是刺激軟骨細胞和滑膜分泌iN0S和N0，加速關節軟骨蛋白多糖和膠原降解、促進軟骨細胞凋亡，二是通過激活Fas途徑介導軟骨細胞的凋亡〔14,15〕，由于軟骨基質的降解及軟骨細胞的凋亡，引發軟骨細胞生活的微環境惡化,從而影響軟骨細胞的合成功能，使Ⅱ型膠原合成減少，加重軟骨基質合成與降解的紊亂，加上軟骨細胞凋亡的增加，導致關節軟骨的破壞，促發OA的發生發展。

Hulth法通過切斷前交叉韌帶和副韌帶，減弱了關節周圍肌肉和韌帶的保護作用，造成關節不穩定、關節面摩擦增加，部分半月板的切除使脛股關節應力改變，最終關節軟骨退變而導致的發生。本研究說明，KOA動物模型復制成功，且在KOA發病過程中IL-1的失衡、MMP-1的釋放、Ⅱ型膠原的降解以及軟骨細胞的凋亡發揮了重要作用。

CT是一種抗骨吸收劑,通過與破骨細胞上的降鈣素受體結合,抑制破骨細胞功能而用于治療骨質疏松〔6,16〕,目前有研究表明關節軟骨細胞上也有功能性CT受體，CT可使cAMP 表達增加,促進膠原蛋白和蛋白多糖表達而發揮保護軟骨的作用〔17〕。本研究表明CT可能通過抑制IL-1β分泌，恢復軟骨基質的合成與降解平衡，減少軟骨細胞凋亡，對關節軟骨具有一定的保護作用，延緩關節軟骨退變過程。

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〔2014-12-31修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

鄭州市科技發展計劃(2007-15-44)

楊紅梅(1969-)，女，教授，碩士，主要從事骨關節疾病的病理生理學研究。

尤笑迎(1969-)，男，醫學碩士，主任醫師，主要從事骨關節疾病的診治研究。

R684.3

A

1005-9202(2016)15-3648-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.017

1河南醫學高等專科學校