MicroRNA-429靶向抑制occludin及對(duì)糖尿病小鼠腸上皮屏障功能的影響*

盧錫基，　于　濤，　夏忠勝，　單體棟，　歐陽(yáng)慧，　許稷豪，　陳其奎

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510120)

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MicroRNA-429靶向抑制occludin及對(duì)糖尿病小鼠腸上皮屏障功能的影響*

盧錫基，于濤，夏忠勝△，單體棟，歐陽(yáng)慧，許稷豪，陳其奎

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510120)

目的： 探討microRNA-429(miR-429)在體內(nèi)對(duì)糖尿病(DM)小鼠腸上皮細(xì)胞(IECs)內(nèi)閉合蛋白(occludin,Ocln)表達(dá)及腸上皮屏障功能的影響。方法: 構(gòu)建糖尿病小鼠模型(腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素)；通過(guò)尾靜脈注射antagomiRNA-429抑制DM小鼠IECs內(nèi)miR-429的表達(dá)；real-time PCR檢測(cè)miR-429和Ocln mRNA的表達(dá)變化；Western blotting及免疫組化檢測(cè)Ocln蛋白表達(dá)變化；氣相色譜法檢測(cè)小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值；顯色基質(zhì)鱟試劑法檢測(cè)小鼠血漿LPS濃度。結(jié)果: 尾靜脈注射antagomiRNA-429能顯著抑制DM小鼠IECs內(nèi)miR-429的表達(dá)，注射后6 d恢復(fù)至正常小鼠IECs表達(dá)水平。抑制DM小鼠IECs內(nèi)miR-429表達(dá)后，Ocln表達(dá)顯著提高(P<0.05)，小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值及血漿LPS水平均明顯下降(P<0.05)。結(jié)論: AntagomiRNA-429能有效抑制DM小鼠IECs內(nèi)miR-429的表達(dá), 進(jìn)而使小鼠IECs內(nèi)Ocln的表達(dá)升高，從而使腸上皮屏障功能部分恢復(fù)。

糖尿?。?MicroRNA-429； 閉合蛋白； 腸上皮屏障功能

MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小RNA分子，長(zhǎng)度約為19～25個(gè)核苷酸，在生物體內(nèi)主要參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，從而參與生長(zhǎng)發(fā)育、增殖分化與凋亡等一系列生命活動(dòng)[1]。閉合蛋白(occludin,Ocln)是細(xì)胞間緊密連接的重要組成部分，其在緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能維持中均起著重要作用[2- 3]。我們過(guò)去研究發(fā)現(xiàn)[4]，糖尿病(diabetes mellitus，DM)小鼠腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells，IECs)內(nèi)Ocln表達(dá)明顯低于正常小鼠，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。以往有研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥性腸病也存在Ocln表達(dá)降低及腸上皮屏障功能障礙，而miRNA在其中起著重要調(diào)控作用[5- 6]。miRNA-429是miR-200家族的一個(gè)成員，其在細(xì)胞增殖、凋亡和腫瘤形成等過(guò)程中起著重要作用[7- 8]，但其在糖尿病腸病中的作用尚不清楚。本研究利用特異性miRNA抑制劑antagomiRNA-429降低miRNA-429的表達(dá)，觀察其對(duì)Ocln表達(dá)及腸上皮屏障功能的影響。

材　料　和　方　法

1動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J小鼠32只，雌雄各半，6～8周齡，18～20 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。IECs從小鼠小腸中分離提取。

2主要試劑

鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)及乳果糖、甘露醇購(gòu)自Sigma；EDTA和DTT購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Ocln、β-actin兔抗多克隆抗體及HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)均購(gòu)自CST；TRIzol?試劑盒購(gòu)自Life Technology；miRNA專(zhuān)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Clontech Laboratories;mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa；ECL試劑盒購(gòu)自Santa Cruz；免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；顯色基質(zhì)鱟試劑盒購(gòu)自廈門(mén)鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。AntagomiRNA-429由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成；miRNA逆轉(zhuǎn)錄及PCR所用引物由Clontech Laboratories設(shè)計(jì)合成，其余引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成；PCR擴(kuò)增儀采用Bio-Rad的CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

3主要方法

3.1DM小鼠模型的構(gòu)建將32只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成2組，一組為DM組(26只)，另一組為正常對(duì)照(normal)組(6只)。DM組小鼠給予腹腔內(nèi)注射STZ(70 mg/kg)，1天1次，連續(xù)注射5 d，normal組給予相同體積的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液腹腔內(nèi)注射。1周后測(cè)尾靜脈血隨機(jī)血糖，連續(xù)3次測(cè)量(每天1次，連續(xù)3 d)隨機(jī)血糖值大于16.7 mmol/L者為DM造模成功，造模成功率為92.3%(24/26，其中2只血糖值在12.0～16.7 mmol/L之間，未達(dá)到DM模型的標(biāo)準(zhǔn))。

3.2DM小鼠尾靜脈注射antagomiRNA-429及分組在DM小鼠造模成功后第8周時(shí)，將上述DM組小鼠隨機(jī)分成2組，一組為antagomiRNA-429組(18只)，另一組為DM-NS組(6只)。 AntagomiRNA-429組：給予尾靜脈注射antagomiRNA-429(80 mg/kg)，1天1次，連續(xù)注射3 d，注射后第2、4、6天分別取6只小鼠作進(jìn)一步研究；DM-NS組：給予尾靜脈注射生理鹽水0.2 mL，1天1次，連續(xù)注射3 d。另外，normal組小鼠不做任何處理。

3.3小鼠IECs的分離提取上述各組小鼠眼眶取全血，斷頸處死后，開(kāi)腹并分離完整小腸(從幽門(mén)至回盲部)，沿縱軸切開(kāi)小腸，留取1 cm空腸腸段用于下一步制備石蠟切片，余下腸組織用預(yù)冷的PBS清洗3遍，加入分離液I(PBS+30 mmol/L EDTA+1.5 mmol/L DTT)中，冰上放置20 min，之后將整段小腸轉(zhuǎn)移至分離液II(PBS+30 mmol/L EDTA)中，37 ℃孵育10 min，然后劇烈搖晃30 s，去除腸段，將剩余液體以2 500 r/min離心5 min，去上清，沉淀物即為分離的腸上皮隱窩和絨毛組織，收集沉淀物并置于-80 ℃以作進(jìn)一步研究。

3.4腸黏膜組織學(xué)檢查取上述各組小鼠的小腸組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋并制備組織切片。切片組織常規(guī)脫蠟、水化，過(guò)氧化物酶阻斷劑避光孵育10 min，非免疫山羊血清封閉20 min，Ocln抗體(1∶250)4 ℃孵育過(guò)夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h，鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化物酶孵育10 min，DAB顯色5 min，PBS終止顯色，蘇木素復(fù)染30 s，脫水、封片后置于顯微鏡下觀察。

3.5Real-time PCR采用TRIzol?試劑盒分離純化上述各組IECs的總RNA，分光光度法測(cè)定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。各取0.5 μg總RNA，分別參照miRNA專(zhuān)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說(shuō)明進(jìn)行相應(yīng)real-time PCR。然后進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增， PCR條件為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)，樣本目的基因的相對(duì)表達(dá)率采用ΔΔCt方法計(jì)算，miR-429的表達(dá)以U6為內(nèi)參照，Ocln的表達(dá)以18S rRNA為內(nèi)參照。miR-429順義引物序列為5’-TAATACTGTCTGGTAATGCCG-3’，反義通用引物包含在miRNA專(zhuān)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中；U6順義引物序列為5’-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3’，反義通用引物包含在miRNA專(zhuān)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中；Ocln上游引物為5’-CCTCCAATGGCAAAGTGAAT-3’,下游引物為5’-CTCCCCACCTGTCGTGTAGT-3’；18S rRNA上游引物為5’-GCTAGGAATAATGGAATAGG-3’,下游引物物 5’-ACT TTCGTTCTTGAGGAATG-3’。

3.6Western blotting每組各取總蛋白40 μg在12%的分離膠中進(jìn)行SDS-PAGE分離，然后在冰上以200 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，繼而用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入相應(yīng)Ⅰ抗(Ocln，1∶1 000；β-actin，1∶5 000),4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜10 min 3次，用過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min 3次，曝光、顯影與定影。

3.7血漿LPS濃度測(cè)定將上述各組小鼠所取的全血置于含抗凝劑的離心管中，充分混勻后以3 000 r/min離心10 min，取血漿，參照顯色基質(zhì)鱟試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行血漿LPS濃度測(cè)定。

3.824 h尿液乳果糖/甘露醇比值(lactulose/mannitol ratio, L∶M ratio)上述各組小鼠給予胃內(nèi)灌注乳果糖(每只10 mg)和甘露醇(每只5 mg)，收集24 h尿液，用GC-9A氣相色譜儀檢測(cè)乳果糖及甘露醇濃度并計(jì)算其比值。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1DM小鼠IECs高表達(dá)miR-429

DM小鼠IECs內(nèi)miR-429的表達(dá)顯著高于正常小鼠IECs的表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.miR-429 expression in IECs from normal and DM mice. Mean±SD.n=6.#P<0.05vsnormal group.

圖1正常和DM小鼠IECs中miR-429的表達(dá)情況

2注射antagomiRNA-429后DM小鼠IECs中miR-429表達(dá)逐步降低

如圖2所示，經(jīng)尾靜脈注射antagomiRNA-429后，DM小鼠IECs內(nèi)miR-429的表達(dá)逐步降低(P<0.05)，并在注射后的第6天接近正常小鼠水平，因此我們選定這一天的小鼠來(lái)進(jìn)行腸上皮組織提取用作下一步實(shí)驗(yàn)。

Figure 2.The expression of miR-429 in IECs of DM mice after injection of antagomiRNA-429. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsDM-NS group;#P<0.05vsnormal group.

圖2經(jīng)尾靜脈注射antagomir-429后DM小鼠IECs中miR-429的表達(dá)

3注射antagomiRNA-429后DM小鼠IECs中Ocln表達(dá)明顯升高

經(jīng)尾靜脈注射antagomiRNA-429后第6天，antagomiRNA-429組小鼠IECs內(nèi)Ocln的mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯高于DM-NS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另外，Ocln主要表達(dá)在小鼠IECs的細(xì)胞膜上，尤其集中于腸腔面細(xì)胞連接處，而且antagomiRNA-429組小鼠IECs上的Ocln表達(dá)明顯高于DM-NS組,見(jiàn)圖3。

4注射antagomiRNA-429后DM小鼠血漿LPS濃度及尿液乳果糖/甘露醇比值均明顯降低

DM小鼠血漿LPS濃度遠(yuǎn)高于正常小鼠。經(jīng)尾靜脈注射antagomiRNA-429后第6天，antagomiRNA-429組小鼠血漿LPS濃度明顯低于DM-NS組(P<0.05)。DM小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值顯著高于正常小鼠。經(jīng)尾靜脈注射antagomiRNA-429后第6天，antagomiRNA-429組小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值明顯低于DM-NS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖4。

討　　論

閉合蛋白是細(xì)胞間緊密連接的重要組成部分，其在緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能維持中均起著重要作用。過(guò)去關(guān)于Ocln在腸屏障功能中作用的研究主要集中在腸道炎性疾病。Burewer等[9]的研究表明，在腸道炎性疾病中促炎因子IFN-γ和TNF-α可促使Ocln從胞膜轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)中并促進(jìn)腸上皮細(xì)胞凋亡，從而使腸上皮細(xì)胞間緊密連接受損，破壞腸上皮屏障。王愛(ài)麗等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠腸道缺血再灌注損傷模型中，腸組織Ocln蛋白表達(dá)明顯降低，腸黏膜通透性增加。另外，Schumann等[11]報(bào)道了在難治性乳糜瀉的病人中也存在腸上皮細(xì)胞間緊密連接受損、腸上皮屏障功能障礙。在我們過(guò)去的研究中發(fā)現(xiàn)[4]，在DM小鼠中也存在腸上皮細(xì)胞內(nèi)Ocln表達(dá)下降，腸上皮緊密連接受損，以及腸屏障功能障礙，但其調(diào)節(jié)因素尚待進(jìn)一步研究。

Figure 3.The expression and distribution of Ocln in IECs of DM mice after injection of antagomiRNA-429 (immunohistochemistry,×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsDM-NS group；#P<0.05vsnormal group.

圖3注射antagomiRNA-429后DM小鼠IECs中Ocln的表達(dá)及分布變化

Figure 4.The plasma LPS concentration (A) and 24 h urinary lactulose/mannitol ratio (B) of DM mice after injection of antagomiRNA-429. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsDM-NS group;#P<0.05vsnormal group.

圖4注射antagomiRNA-429后DM小鼠血漿LPS濃度及尿液乳果糖/甘露醇比值的變化

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)DM小鼠IECs中miR-429的表達(dá)較正常小鼠顯著升高，而且經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，Ocln可能為miR-429的調(diào)控靶點(diǎn)，為了進(jìn)一步研究DM小鼠IECs中上調(diào)的miR-429與Ocln的表達(dá)及腸屏障功能的的關(guān)系，根據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法我們構(gòu)建了一種經(jīng)特殊化學(xué)修飾的miR-429的拮抗劑——antagomiRNA-429，經(jīng)尾靜脈注射antagomiRNA-429后DM小鼠IECs中miR-429的表達(dá)明顯下調(diào)，并且在注射后第6天恢復(fù)至正常小鼠的水平。在注射后第6天，DM小鼠IECs中Ocln的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高，提示DM小鼠中miR-429表達(dá)上調(diào)可抑制Ocln的表達(dá)。

LPS普遍存在于革蘭氏陰性菌的菌壁中，在細(xì)菌受損或死亡時(shí)被釋放出來(lái)。眾所周知，人和動(dòng)物腸道中均存在大量的細(xì)菌，這些細(xì)菌在受損或死亡時(shí)也會(huì)釋放出大量的LPS，在正常狀態(tài)下受制于腸屏障作用，僅有極少量LPS能透過(guò)腸上皮入血，而腸上皮細(xì)胞間緊密連接在此起著十分重要的作用。病理狀態(tài)下，腸上皮細(xì)胞間緊密連接受損導(dǎo)致腸屏障功能障礙，腸腔中的LPS經(jīng)腸上皮細(xì)胞間隙大量入血，引起內(nèi)毒素血癥，造成全身各器官組織損害。在過(guò)去的研究中[4]，我們發(fā)現(xiàn)DM小鼠腸道中需氧菌與厭氧菌的數(shù)量與正常小鼠并無(wú)顯著差異，因此，血漿LPS濃度可作為反映腸屏障功能改變的一個(gè)可靠指標(biāo)。另外，在腸道中甘露醇是經(jīng)細(xì)胞途徑吸收，而乳果糖是經(jīng)細(xì)胞間途徑吸收，即通過(guò)細(xì)胞間緊密連接被動(dòng)吸收，兩者均不易代謝而經(jīng)腎臟排出。正常情況下乳果糖只有少量吸收入血，而在腸上皮細(xì)胞間緊密連接受損時(shí)，乳果糖大量吸收入血并從腎臟排出，而甘露醇的吸收基本不受影響，因此測(cè)定小鼠尿液中乳果糖/甘露醇比值是檢測(cè)小鼠腸道通透性的一個(gè)常用而可靠的指標(biāo)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)DM小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值和血漿LPS濃度均顯著高于正常小鼠，而且經(jīng)注射antagomiRNA-429后，DM小鼠中這2個(gè)指標(biāo)均明顯降低，但仍高于正常小鼠水平，提示其腸屏障功能得以部分恢復(fù)，同時(shí)，這也反映了miR-429的高表達(dá)是造成DM小鼠腸屏障功能障礙的一個(gè)重要原因。

值得注意的是，盡管應(yīng)用antagomiRNA-429抑制DM小鼠IECs內(nèi)miR-429表達(dá)后，Ocln表達(dá)明顯升高，但其水平仍低于正常水平(P<0.05)，提示其表達(dá)還受到其它因素的調(diào)節(jié)，如炎癥因子、其它microRNA等，據(jù)我們所知，過(guò)去在這方面的研究主要集中在炎癥性腸病、腸易激綜合征、酒精性肝病等方面[9, 13-14]，而在糖尿病腸病中的研究少之又少。另一方面，雖然應(yīng)用antagomiRNA-429后DM小鼠尿液乳果糖/甘露醇比值以及血漿LPS水平均明顯降低了，但仍明顯高于正常小鼠的水平，提示腸屏障功能并未完全恢復(fù)，究其原因，一方面可能是Ocln的表達(dá)同時(shí)還受到一些其它因素的影響，另一方面，其它緊密連接相關(guān)蛋白如ZO-1、Claudins、JAM等的表達(dá)也可能發(fā)生變化，從而影響腸屏障功能，因此，這方面的變化及其機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究首先發(fā)現(xiàn)了DM小鼠IECs內(nèi)miR-429表達(dá)上調(diào)，并在體內(nèi)應(yīng)用antagomiRNA-429有效降低其表達(dá)水平, 進(jìn)而使小鼠IECs內(nèi)Ocln的表達(dá)升高，腸上皮屏障功能得到部分恢復(fù)，證實(shí)miR-429表達(dá)上調(diào)與DM小鼠腸上皮屏障功能障礙密切相關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

Effect of targeted inhibition of occludin by microRNA-429 on intestinal epithelial barrier function in diabetic mouse

LU Xi-ji, YU Tao, XIA Zhong-sheng△, SHAN Ti-dong, OUYANG Hui, XU Ji-hao, CHEN Qi-kui

(DepartmentofGastroenterology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:xiazhsh@163.com)

AIM: To investigate the effect of microRNA-429 (miR-429) on the expression of occludin (Ocln) in intestinal epithelial cells (IECs) and intestinal epithelial barrier function in diabetic mice. METHODS: Diabetes mellitus mouse model was induced by intraperitoneal injection of streptozocin. The expression of miR-429 in IECs of diabetic mice was inhibited by antagomiRNA-429 injected via tail vein. The expression of miR-429 and mRNA expression of Ocln were detected by real-time PCR. The protein expression of Ocln was determined by Western blotting and immunohistochemistry. The urinary lactulose/mannitol ratio was measured by gas chromatography. The plasma LPS concentrations in the mice were measured by chromogenic end-point TAL kit. RESULTS: The results of real-time PCR confirmed that the expression of miR-429 in IECs of diabetic mice was remarkably inhibited by tail-vein administration of antagomiRNA-429, and resumed to similar level of normal mice on the 6th day after the administration. After suppressing the level of miR-429, the expression of Ocln in IECs of diabetic mice increased significantly (P<0.05), while the urinary lactulose/mannitol ratio and the plasma LPS concentration decreased obviously (P<0.05). CONCLUSION: AntagomiRNA-429 effectively suppresses miR-429 expression in IECs of diabetic mice, and then enhances the expression of Ocln and partially resumes the intestinal epithelial barrier function.

Diabetes mellitus; microRNA-429; Occludin; Intestinal epithelial barrier function

1000- 4718(2016)04- 0696- 05

2015- 11- 09

2016- 01- 20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81370475)

Tel: 86-20-81332598; E-mail: xiazhsh@163.com

R363.2; R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.019

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