沉默URG11基因對前列腺癌LNCaP細胞增殖、遷移與侵襲的影響*

潘　斌,　鄧志海，　吳友科，　梁蔚波，　曾傳蓉，　劉海平△

(1暨南大學附屬第一醫院泌尿外科，廣東 廣州 510632； 2連平縣第二人民醫院外科，廣東 河源 517139)

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沉默URG11基因對前列腺癌LNCaP細胞增殖、遷移與侵襲的影響*

潘斌1,鄧志海1，吳友科2，梁蔚波1，曾傳蓉2，劉海平2△

(1暨南大學附屬第一醫院泌尿外科，廣東 廣州 510632；2連平縣第二人民醫院外科，廣東 河源 517139)

目的： 觀察上調基因11(up-regulated gene 11,URG11)在前列腺癌細胞系中的表達及降低URG11表達對人前列腺癌LNCaP細胞增殖和侵襲能力的影響。方法：用real-time PCR和Western blot檢測前列腺癌細胞系和正常前列腺上皮細胞系中URG11 mRNA和蛋白水平；設計針對URG11基因的siRNA靶序列，轉染LNCaP細胞，采用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡，MTS測定LNCaP細胞增殖能力，劃痕和侵襲實驗評價LNCaP細胞遷移及侵襲能力。結果：在LNCaP、DU145、PC3前列腺癌細胞系和RWPE-1正常前列腺上皮細胞系中URG11 mRNA和蛋白表達水平存在顯著差異，在前列腺癌細胞中URG11 mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。 與對照組相比，轉染URG11 siRNA的LNCaP細胞增殖停滯在G1/S期并誘導前列腺癌細胞凋亡，轉染組的細胞凋亡率為8.79%±0.12%，而且LNCaP腫瘤細胞的遷移及侵襲能力明顯下降(P<0.05)。結論： URG11在前列腺癌系中高表達。通過RNAi沉默URG11基因能明顯抑制LNCaP細胞增殖和侵襲能力，并誘導細胞凋亡。

上凋基因11； 前列腺癌； RNA干擾； 腫瘤侵襲

上調基因11(up-regulated gene 11,URG11)基因位于人類11號染色體長臂，編碼一種70 kD的蛋白，含有5個VWFC結構域和1個C型植物凝集素結構域，這些結構域主要的功能是調節細胞的黏附、遷移、相互作用以及與信號轉導密切相關[1- 2]。有研究證實URG11在肝癌、胃癌和腸癌等多種腫瘤細胞和組織中過表達，并可促進腫瘤的發生發展，被認為是細胞生長的一個調節因子。我們前期實驗通過免疫組化方法證實URG11在前列腺癌組織中過表達，且與前列腺癌的Gleason評分及臨床分期正相關，與前列腺癌發生發展密切相關[3]。但URG11基因在前列腺癌細胞中的功能尚缺乏深入研究。本研究分析URG11在前列腺癌癌細胞系及其正常前列腺細胞中的表達情況，并進一步通過RNAi技術觀察降低URG11基因表達對LNCaP前列腺癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響。

材　料　和　方　法

1材料和試劑

人前列腺癌細胞系LNCaP和DU145由暨南大學附屬第一醫院中心實驗室保存，人前列腺癌細胞系PC3由南方醫科大學附屬南方醫院實驗室惠贈及人永生化前列腺上皮細胞系RWPE-1由廣州醫科大學藥學院實驗室惠贈。RPMI-1640培養液和胎牛血清購自HyClone；Transwell細胞培養板(BD)；TRIzol試劑和Lipofectamine 2000(Invitrogen)；URG11多克隆抗體購自GengTex；Matrigel基質膠和流式細胞儀(BD)；SYBR Green PCR Master Mix (Toyobo)；ABI 7500 全自動熒光定量PCR儀(ABI)。

2細胞培養

所有細胞置于RPMI-1640培養液中，5% CO2、37 ℃，飽和濕度條件下恒溫培養，取對數生長期細胞進行檢測。

3Real-time PCR檢測LNCaP、DU145、PC3前列腺癌細胞和永生化前列腺上皮細胞系RWPE-1中URG11的mRNA表達

組織RNA按照TRIzol試劑說明書提取，并用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。引物由上海生工公司合成。URG11的上游引物為 5’- TGAATCAAGGAGTCGCTGGAC-3’，下游引物為 5’-GCATCTCACTGGAACACAAG-3’； GAPHD為內參照, 上游引物為 5’-CAACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物為 5’-CCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。取總RNA 1 μg，采用Toyobo的逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應。反應條件如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。每個樣品實驗重復3次。以2-ΔΔCt法計算mRNA的表達量。

4細胞轉染

待細胞融合至50%，采用Lipofectamine 2000方法轉染。URG11 siRNA由Sigma提供。siRNA干擾效率篩選實驗結果顯示3條序列中以URG11 siRNA 50 nmol/L的抑制效率最高。本實驗共分3個組。轉染組：以抑制作用最強的URG11 siRNA轉染LNCaP細胞；陰性對照組:以陰性對照siRNA轉染LNCaP細胞；空白對照組：既不加入Lipofectamine 2000也不加入siRNA，同步進行實驗[4]。

5實時熒光定量PCR測定轉染后各組LNCaP細胞URG11 mRNA表達水平

方法同前。URG11上游引物為5’-CTTCAGCACTTTCCATGATG-3’，下游引物為5’-AGGGCTGTGGAGAGTCTAGA-3’； 18S rRNA上游引物為5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’，下游引物為5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’。

6Western blot檢測LNCaP、DU145、PC3前列腺癌細胞和永生化前列腺上皮細胞RWPE-1的URG11蛋白表達及轉染后各組LNCaP細胞URG11 蛋白表達水平

提取總蛋白并測其濃度。進行SDS-PAGE，PVDF膜5%的脫脂奶粉封閉，TBST液洗滌，加Ⅰ抗(URG11兔抗人多克隆抗體和內參照GAPHD單克隆抗體)4℃孵育過夜，加Ⅱ抗室溫避光孵育，洗膜后加底物化學發光顯影。用Quantity One圖像分析軟件進行條帶灰度掃描，分析結果。

7MTS法檢測轉染后LNCaP細胞增殖

取對數生長轉染后細胞，收集各組各時點的細胞(0、24、48、72 h)加入CellTiter 96 AQueous單溶液細胞增殖檢測試劑(Promega)，比例為1∶10。孵育4 h后，酶標儀讀板，MTS檢測讀取A490數據。

8流式細胞術檢測轉染后細胞凋亡

細胞轉染48 h后每樣收集1×106細胞，加入1.25 μL Annexin V-FITC，室溫1 000×g離心5 min，去上清，將細胞用0.5 mL的1×結合緩沖液輕輕重懸，加入10 μL PI，用流式細胞儀檢測分析。

9流式細胞術檢測細胞周期

細胞轉染48 h后收集1×106細胞，PBS洗2次， 70%乙醇，4 ℃固定過夜，加入500 μL PBS含50 mg/L PI，100 mg/L RNase A，0.2% Triton X-100，4 ℃避光孵育30 min。以標準程序用流式細胞儀檢測，一般計數(2～3)×104個細胞，結果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。

10Transwell檢測細胞侵襲能力

收集各處理組細胞，計數1×105細胞，Matrigel在Transwell小室成膠后，用100 μL無血清培養基重懸，加入Transwell細胞培養板的小室上室。在37 ℃、5%CO2孵育24 h后，取出小室，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌1次，結晶紫染色10 min，PBS洗滌1次，顯微鏡下觀察細胞是否穿過小孔，如有穿過終止其它實驗組，并拍照統計使用正置顯微鏡進行觀察,200倍光鏡5個視野計數穿膜細胞個數,并計算平均每個視野的穿膜細胞數,每組重復3次。

11細胞遷移實驗

將處于對數生長期的濃度約為1×109/L細胞，制成懸液均勻接種于6孔培養板中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中常規培養。 對照組用無血清RMPI-1640培養基培養，實驗組分別用含藥的無血清RMPI-1640培養基進行干預。分別于劃痕后0、6、24、48 h取樣，拍照。在倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合情況。Image-Pro Plus 6.0軟件測量各組細胞相同時點任意8個部位劃痕寬度，計算細胞遷移率以反映各組細胞運動遷移能力。

12統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，兩樣本比較采用t檢驗，多樣本均數的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

1Real-time PCR檢測URG11基因在前列腺癌細胞系和正常前列腺上皮細胞系的mRNA表達水平

URG11在LNCaP、DU145、PC3前列腺癌細胞系和RWPE-1細胞系的real-time PCR相對定量分別為19.94±0.76、8.96±0.31、7.73±0.36和1.00±0.00，各前列腺癌細胞系中URG11的mRNA均較RWPE-1細胞系高，差異有統計學意義，見圖1。這說明URG11基因水平在前列腺癌細胞中高度表達。

Figure 1.Expression of URG11 mRNA in prostate cancer cell lines and normal prostate epithelial cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRWPE-1 group.

圖1URG11 mRNA在前列腺癌細胞和前列腺上皮細胞中的相對表達量

2Western blot檢測URG11在前列腺癌細胞系和正常前列腺上皮細胞系的表達水平

前列腺癌細胞系LNCaP、DU145、PC3和永生化前列腺上皮細胞系RWPE-1中URG11蛋白表達強弱有差異，其中LNCaP表達最高，DU145和PC3表達次之，RWPE-1表達最弱，見圖2。

Figure 2.Expression of URG11 protein in prostate cancer cell lines and normal prostate epithelial cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRWPE-1 group.

圖2URG11蛋白在前列腺癌細胞系和正常前列腺上皮細胞系中的表達差異

3Western blot檢測URG11干擾后LNCaP前列腺癌細胞的表達水平

干擾后，LNCaP前列腺癌細胞中URG11蛋白表達被抑制，見圖3。

4觀察URG11干擾后對LNCaP腫瘤細胞增殖的影響

干擾URG11之后，LNCaP細胞生長受到抑制。進一步計算各時點、各處理組的增殖率，組間差異均有統計學意義(P<0.05)。進一步，通過毒性分析也可以看出干擾URG11之后，細胞毒性增強，死亡細胞增加，見圖3。

5觀察URG11干擾后對LNCaP腫瘤細胞細胞周期及凋亡率的影響

抑制URG11基因后，腫瘤細胞停留在G1期的比例明顯增加，抑制細胞分化增殖。進一步，通過Annexin V/PI染色檢測細胞凋亡，可明顯看到凋亡細胞增加，見圖4、5。

Figure 3.The growth of LNCaP cells transfected withURG11 siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC siRNA group.

圖3抑制URG11基因對LNCaP細胞增殖的影響

Figure 4.The cell cycle of LNCaP cells transfected withURG11 siRNA detected by flow cytometry.

圖4抑制URG11基因對LNCaP細胞細胞周期的影響

Figure 5.The apoptosis of LNCaP cells transfected withURG11 siRNA detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC siRNA group.

圖5抑制URG11基因對LNCaP細胞凋亡的影響

6劃痕實驗觀察URG11干擾后對LNCaP腫瘤細胞遷移的影響

劃痕實驗顯示，正常生長的腫瘤細胞及NC siRNA干擾對照組的腫瘤細胞在劃痕48 h后逐漸愈合，劃痕變小。而URG11干擾后，劃痕不會愈合，甚至因為細胞凋亡而劃痕間隙變大。統計結果顯示，干擾URG11隨時點影響LNCaP腫瘤細胞的遷移，見圖6。

7Transwell遷移實驗檢測URG11干擾后對LNCaP腫瘤細胞遷移和侵襲的影響

將LNCaP腫瘤細胞培養于Transwell系統內，于48 h后固定細胞染色。實驗結果表明，干擾URG11后，細胞的遷移及侵襲能力明顯下降，見圖7、8。

討　　論

URG11作為乙肝病毒X蛋白的效應器而且能夠促進肝癌的進展，同時亦證實除了肝癌，在其它腫瘤中表達上調，在胃癌、結腸癌、肺癌、食管癌和乳腺癌URG11蛋白的表達要比癌旁組織高，URG11在惡性腫瘤的發生發展起一定的作用[5-6]。但目前URG11 在前列腺癌組織和細胞中表達及相關研究報道甚少。前期實驗證實URG11在前列腺癌組織中高表達，陽性表達率為70.6%，且與前列腺癌的Gleason評分、TNM分期呈正相關，與前列腺癌發生發展密切相關[3]。

本研究中，我們進一步檢測URG11在前列腺癌系和正常前列腺上皮細胞中mRNA和蛋白的表達，顯示前列腺癌系細胞URG11 mRNA和蛋白水平均較永生化前列腺上皮細胞明顯上調。此外，我們還可以注意到前列腺癌細胞之間URG11 mRNA和蛋白的表達也是存在差異的，這很可能是由于不同前列腺癌細胞本身所具有的不同特性所決定的。我們認為URG11可能參與了早期前列腺癌的形成發展，因大多數前列腺癌早期都是雄激素依賴型，同時這也為在雄激素信號通路以外探尋前列腺癌發生發展的分子機制提供了一種新的途徑。

URG11作為類似細胞生長調節因子，對前列腺癌細胞中的生物學如何影響，仍未明了，我們設計了URG11的小分子干擾片段并轉染URG11高表達的 LNCaP細胞，使前列腺癌細胞增殖停滯在G1/S期并誘導前列腺癌細胞凋亡，抑制細胞分化增殖，說明URG11基因在前列腺癌細胞系中高表達，可增強前列腺癌細胞的增殖能力，促進腫瘤的發展。抑制LNCaP前列腺癌細胞中URG11表達，細胞劃痕不會愈合，甚至因為細胞凋亡而劃痕間隙變大，干擾URG11隨時間影響LNCaP腫瘤細胞的遷移，細胞的遷移及侵襲能力明顯下降，表明下調URG11表達，可抑制前列腺癌細胞生長，為前列腺癌基因靶向治療提供新的靶點。

Figure 6.The migration ability of LNCaP cells transfected withURG11 siRNA detected by wound-healing assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC siRNA group.

圖6劃痕實驗觀察抑制URG11基因對LNCaP細胞遷移的影響

Figure 7.The migration ability of LNCaP cells transfected withURG11 siRNA detected by Transwell migration assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC siRNA group.

圖7Transwell實驗觀察抑制URG11基因對LNCaP細胞遷移的影響

Figure 8.The invasion ability of LNCaP cells transfected withURG11 siRNA by Transwell invasion assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC siRNA group.

圖8Transwell實驗觀察抑制URG11基因對LNCaP細胞侵襲的影響

Lian 等[5]研究發現URG11也能促進肝癌細胞系的生長、增殖及分化，亦同樣加速肝癌細胞由G1期向S期發展，用siRNA干擾URG11表達可以明顯抑制細胞非依賴性生長、集落形成能力。將URG11 siRNA注射到裸鼠的瘤體可以顯著腫瘤抑制的生長。有研究[7-8]利用RNA干擾技術下調URG11基因的表達，可以使胃癌細胞增殖停滯，明顯抑制腫瘤細胞的生長。Fan等[2]利用腺病毒介導轉染siRNA肝癌細胞，靶向沉默URG11基因后，結果顯示可抑制肝癌細胞G1期向S期進展，cyclin D1、CDK4、 pRb 和Bcl-2表達也都降低，并誘導肝細胞癌凋亡和抑制增殖，抑制裸鼠的瘤體生長，認為沉默URG11基因在體內和體外均可抑制肝癌細胞的生長，其可作為肝癌分子治療新的靶點。

我們研究發現URG11在前列腺癌細胞高表達，通過抑制URG11表達，可顯著抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，這為前列腺癌的基因治療提供新的思路，但對其具體調控的分子機制仍需進一步研究。

[1]Lian Z, Liu J, Li L, et al. Up regulated expression of a unique gene by hepatitis B x antigen promotes hepatocellular growth and tumorigenesis[J]. Neoplasia, 2003, 5(3): 229-244.

[2]Fan R, Li X, Du W, et al. Adenoviral-mediated RNA interference targeting URG11 inhibits growth of human hepatocellular carcinoma[J]. Int J Cancer, 2011, 128(12): 2980-2993.

[3]潘斌, 鄧志海, 洪余德, 等. URG11在前列腺癌組織中的表達及臨床意義[J].中華實驗外科雜志, 2014, 31(12):2661-2663.

[4]李金, 黃海, 賴義明, 等. 沉默婆羅雙樹樣基因4對前列腺癌LNCaP細胞增殖和凋亡生物學行為的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2015，31(3):435-439.

[5]Lian Z, Liu J, Li L, et al. Enhanced cell survival of Hep3B cells by the hepatitis B x antigen effector, URG11, is associated with up regulation of beta-catenin[J]. Hepatology, 2006, 43(3): 415-424.

[6]Zou X, Li X, Liu J, et al. Preparation and characterization of a specific monoclonal antibody against a new gene product: URG11[J]. Hybridoma, 2006, 25(6): 378-381.

[7]Du R, Xia L, Sun S, et al. URG11 promotes gastric cancer growth and invasion by activation of beta-catenin signalling pathway[J]. J Cell Mol Med, 2010, 14(3): 621-635.

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Effect of URG11 gene silencing on proliferation and invasion abilities of human prostate cancer cells

PAN Bin1, DENG Zhi-hai1, WU You-ke2, LIANG Wei-bo1, ZENG Chuan-rong2, LIU Hai-ping2

(1DepartmentofUrology,FirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofSurgery,LianpingSecondPeople′sHospital,Heyuan517139,China.E-mail:urol8518@126.com)

AIM: To investigate the expression of up-regulated gene 11 (URG11) in prostate cancer cell line and the effect ofURG11 siNRA on the proliferation and invasion of human prostate cancer LNCaP cells. METHODS: The mRNA and protein levels of URG11 in prostate cancer cell lines and normal prostate epithelial cell line were evaluated by real-time PCR and Western blot. LNCaP cells were transfected with designed siRNA using the liposome method. The proliferation, apoptosis, migration and invasion abilities of the LNCaP cells were evaluated by MTS assay, flow cytometry,wound-healing assay and Transwell assay. RESULTS: The expression of URG11 at mRNA and protein levels in the DU145, PC3, LNCaP cell lines was significantly higher than that in RWPE-1 cell line. Compared with the control group, the proliferation of LNCaP cells withURG11 siRNA was stagnant in G1/S phase and induced apoptosis. The proliferation of LNCaP cells at 0 h, 24 h, 48 h and 72 h was inhibited afterURG11 expression was down-regulated (P<0.05). Transwell assay showed that migration (P<0.05) and invasion (P<0.05) were also inhibited. CONCLUSION: URG11 is highly expressed in prostate cancer. Silencing ofURG11 significantly inhibits the proliferation and invasion and induces apoptosis of LNCaP cells.

Up-regulated gene 11; Prostate cancer; RNA interference; Neoplasm invasion

1000- 4718(2016)04- 0658- 07

2015- 12- 23

2016- 02- 04

廣東省醫學科學技術研究基金資助項目(No. A2015557);中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(No. 21613317)

Tel： 0762-4552861； E-mail： urol8518@126.com

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.013

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