阿托伐他汀對快速起搏兔房顫模型心房電重構的影響

宋學蓮，　齊曉勇，　黨　懿，　李英肖，　楊　倩

(河北醫科大學附屬河北省人民醫院心內科，河北 石家莊 050000)

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阿托伐他汀對快速起搏兔房顫模型心房電重構的影響

宋學蓮，齊曉勇△，黨懿，李英肖，楊倩

(河北醫科大學附屬河北省人民醫院心內科，河北 石家莊 050000)

目的： 觀察阿托伐他汀(ATO)對快速起搏兔房顫模型心房電重構、心房肌離子通道蛋白及心臟功能的影響，探討阿托伐他汀防治心房顫動的電生理機制。方法: 30只新西蘭大白兔開胸植入心房起搏和測試電極，采用特制動物心臟起搏器快速起搏心房的方法建立兔房顫模型，將其分為對照組、起搏組和藥物組。藥物組預先給予阿托伐汀鈣片2 mg·kg-1·d-1灌胃7 d，起搏組和藥物組快速起搏心房48 h，期間藥物組持續給藥處理，分別于0 h、8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h測量心房有效不應期，計算心房頻率適應性，觀察心臟大小及心功能的變化，比較各組心房肌細胞離子通道蛋白CaLα1和Kv4.3的表達差異。結果: 與對照組相比，藥物組和起搏組心房有效不應期縮短，頻率適應性下降，心房肌細胞離子通道蛋白CaLα1及Kv4.3表達水平降低(P<0.05)，其中以起搏組變化最為明顯。快速起搏心房48 h后，起搏組和藥物組左房較對照組增大(P<0.05)，而左心室大小及射血分數起搏前后均無明顯差異。結論: 短期快速心房起搏可引起心房有效不應期縮短，導致心房頻率適應性不良，阿托伐他汀預處理可有效改善快速起搏誘導的兔心房電重構，而對心臟結構影響不大。進一步研究發現阿托伐他汀可在一定程度上抑制心房肌鉀、鈣離子通道蛋白水平降低，這可能是其改善電重構的機制之一。

心房顫動； 阿托伐他汀； 電重構

他汀類藥物即羥甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑，其降低膽固醇、調脂穩定斑塊的作用已廣泛應用于臨床，可明顯降低心血管事件的發生，在冠心病的一級、二級預防中有著重要的作用。隨著基礎實驗的深入和臨床實驗的開展，人們發現使用他汀類藥物在其降脂作用尚未顯現時即可產生獲益，提示他汀類藥物有獨立于降脂之外的作用，稱之為他汀的多效性。近年來對于他汀在房顫防治方面的作用研究較多，但是并無明確結論，尤其是他汀對于房顫電生理方面影響的機制爭論較多。本研究通過建立心房快速起搏(atrial tachypacing, ATP)兔模型，模擬房顫狀態，觀察阿托伐他汀(atorvastatin，ATO)對快速起搏兔心房有效不應期及心房肌細胞離子通道的變化，探討其影響心房電重構的機制。

材　料　和　方　法

1動物和材料

選用雄性新西蘭大白兔30只作為實驗對象，體重2.5～3.0 kg，由河北醫科大學動物實驗中心提供；動物心臟起搏器型號為FDM30，起搏電壓5 V，脈沖頻率600 min-1；ATO鈣片為輝瑞制藥有限公司產品；抗L型鈣離子通道α1亞單位CaLα1、抗鉀離子通道Kv4.3和內參照β-actin抗體均購自北京博奧森公司。采用Philips IU22超聲診斷儀測定各項心臟超聲指標；用蘇州東方DF-5A型電生理刺激儀測定電生理指標。

2實驗方法

2.1兔房顫模型建立將實驗動物隨機分為對照組，即非起博(nonpacing，NP)組、ATP組和ATO藥物組，每組各10只。對照組和房顫組的動物術前7 d給予生理鹽水10 mL/d灌胃，ATO組給予ATO鈣片2 mg·kg-1·d-1(溶于10 mL生理鹽水)灌胃，后續處理期間持續給藥。灌胃7 d后制作房顫模型。3%戊巴比妥鈉以1 mL/kg經耳緣靜脈麻醉家兔后，仰臥位固定于手術臺上，備皮，于胸骨左緣第3、4肋間區，打開胸腔，暴露心臟，找到左心房，將起搏電極與測試電極并列與左心耳結扎，引出電極，關閉胸腔，將電極沿皮下隧道引導至右腋后區，應用電生理刺激儀分別測試2條電極，保證裸露導線與心房肌接觸良好，且與胸壁絕緣。于家兔脊柱旁側制作起搏器囊袋，慶大霉素2×104U沖洗囊袋，連接起搏電極與動物起搏器并固定，測試電極固定于皮下，留待電生理指標測定。

2.2電生理指標測定造模動物休息3 d后，動物起搏器以600 bpm發放脈沖刺激起搏組與藥物組，對照組不給予刺激，分別于刺激0 h、8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h測定心房有效不應期(atrial effective refractory period，AERP)，計算心房頻率適應性。測定方法：(1)AERP：應用心臟電生理刺激儀連接測試電極，采用S1S2程控刺激方案，分別以150 ms和200 ms兩個基礎周長進行S1S2負掃描，S1S2呈8∶1，遞減步長為5 ms，以S2后不能下傳心房的最長間期為有效不應期，分別記為AERP150和AERP200，分別測量3次，取平均值。(2)AERP頻率適應性:以AERP200-AERP150表示，正常表現為隨起搏周長延長而延長，其差值越大反映心房適應功能越好，反之則適應功能不良。

2.3心臟超聲指標測定應用超聲診斷儀于動物心臟起搏器刺激前后行經胸無創心臟超聲檢查，在二維超聲引導下取左室長軸切面，在M型圖像上，采用Teichbolz法測量左房長軸(left atrial dimension，LAD)、左室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic dimension，LVESD)、左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)和左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)。

2.4心房肌細胞離子通道蛋白的測定依據實驗分組在實驗結束后麻醉家兔，無菌技術開胸，迅速取出心臟，在無菌生理鹽水中漂洗心臟，剪下左心房，分別剪碎，用RIPA裂解液抽提心房肌組織總蛋白，Bradford比色法測定抽提蛋白的濃度。按照說明書標準操作步驟，蛋白樣品與4×蛋白質凝膠電泳上樣緩沖液混合后電泳，然后采用半干轉的方法轉移到PVDF膜，PVDF膜經5%BSA封閉2 h，于經PBS稀釋的Ⅰ抗工作液中4 ℃反應過夜，在經1×PBST稀釋3 000倍的Ⅱ抗工作液中處理90 min，蛋白條帶通過顯影定影液顯色后，采用UVP分析儀器，對膠片進行掃描，然后括住每一個條帶，系統自動生成灰度值。

納入標準：（1）根據 2012 年中華醫學會消化病學分會炎癥性腸病學組制定的 IBD 診斷標準確診為IBD者，患者的認知功能正常；（2）能夠配合研究和完成問卷測查。且本研究患者均知情同意并經過醫院倫理委員會批準。

3統計學處理

應用SPSS 13.0 統計學分析軟件對數據進行分析，結果數據用均數±標準差(mean±SD)表示；各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結　　果

1動物存活情況

對照組家兔因手術死亡2只，起搏組和藥物組各有2只因起搏電極脫位未完成實驗而剔除。

2AERP的變化

不同起搏周長下，3 組基礎AERP間的差異無統計學顯著性，在快速起搏8 h后，起搏組AERP150較起搏前縮短6.49 ms，較對照組縮短7.74 ms(P<0.05)，隨著起搏時間延長，AERP150進行性縮短，至起搏48 h后縮短程度達20%以上。藥物組AERP150縮短程度較起搏組輕，心房快速起搏48 h后平均共縮短15.0 ms，縮短程度15.15%，與對照組相應時點相比差異有統計學顯著性(P<0.05)。調整起搏周長為200 ms后，起搏組和藥物組在起搏48 h后AERP分別平均縮短32.88 ms 和15.00 ms，見表1、2。

表1各組在不同起搏時點AERP150的變化

Table 1.Change of AERP150 at different points in each group (ms. Mean±SD.n=8)

Pacingtime(h)NPATPATO0100.25±2.3799.62±6.5899.75±3.918100.87±5.3093.13±5.46▲95.62±3.3716100.02±2.8287.62±6.11▲93.55±3.33*2498.37±4.7184.87±4.54▲91.00±3.38*3299.00±4.5380.25±4.23▲88.00±4.03*4099.47±4.7277.50±4.62▲85.75±4.39*4899.37±2.8775.25±4.33▲84.75±4.46*

▲P<0.05vsNP group；*P<0.05vsATP group.

表2各組在不同起搏時點AERP200的變化

Table 2.Change of AERP200 at different points in each group (ms. Mean±SD.n=8)

Pacingtime(h)NPATPATO0110.62±2.82110.75±5.99112.50±3.928114.25±5.59103.00±5.78▲108.12±3.09▲16112.75±3.80103.50±5.39▲105.12±3.79*▲24111.25±4.1692.12±5.02▲102.62±3.11*▲32112.00±3.7486.37±5.12▲99.25±4.26*▲40111.87±4.9683.00±5.45▲95.75±4.65*▲48112.62±1.8479.75±4.80▲94.25±4.74*▲

▲P<0.05vsNP group；*P<0.05vsATP group.

3頻率適應性的變化

心房快速起搏前各組間心房頻率適應性的差異無統計學顯著性，快速起搏后ATP組的頻率適應性降低最明顯，隨起搏時間延長降低幅度依次增大(P<0.05)，而藥物組頻率適應性變化緩慢，起搏40 h前與NP組比較差異無統計學顯著性，見表3。

表3不同刺激周長下心房頻率適應性的變化

Table 3.Change of the adaption of AERP at different cycle lengths in each group (ms. Mean±SD.n=8)

Pacingtime(h)NPATPATO012.75±1.4812.50±1.1912.75±0.88813.37±1.0610.37±1.06▲12.50±1.19*1612.75±1.288.50±0.92▲11.62±1.18*2412.87±1.127.25±1.03▲11.62±1.06*3213.00±0.926.12±1.12▲11.25±1.48*4012.87±1.125.50±1.06▲10.01±1.06*▲4813.25±1.164.50±0.92▲9.50±0.92*▲

▲P<0.05vsNP group；*P<0.05vsATP group.

4心房大小和心功能的變化

心房快速起搏前各組心臟超聲指標之間的差異無統計學顯著性，起搏48 h后復查心臟超聲，起搏組和藥物組LAD較起搏前增大(P<0.05)，但兩組之間差異無統計學顯著性。3組LVEDD、 LVESD和 LVEF無明顯變化，見表4。

表4快速起搏前后心臟超聲指標的變化

Table 4.Comparison of ultrasonic cardiogram indicators before and after tachypacing (Mean±SD.n=8)

GroupLAD(mm)LVEDD(mm)LVESD(mm)LVEF(%)BeforeATP NP9.32±0.7713.27±0.878.30±0.4072.41±2.76 ATP9.42±1.3013.34±1.158.35±0.6172.05±3.83 ATO9.56±0.9913.10±0.848.40±0.6069.66±3.65AfterATP NP9.41±0.7713.36±0.728.35±0.4171.81±0.65 ATP11.25±1.19▲13.54±1.118.52±0.6171.00±3.05 ATO10.93±0.86*13.25±0.968.41±0.6170.35±3.89

▲P<0.05vsATP (before ATP);*P<0.05vsATO (before ATP).

5鈣離子通道和鉀離子通道蛋白表達的變化

起搏48 h后，測量3組CaLα1和Kv4.3的蛋白表達水平，起搏組和藥物組表達均下降，但起搏組下降更明顯(P<0.05)。兩種目的蛋白表達和內參照β-actin蛋白表達量與理論灰度值相符，見圖1。

Figure 1.The expression of atrial ion channel proteins CaLα1 and Kv4.3. Mean±SD.n=8.▲P<0.05vsNP group;*P<0.05vsATP group.

圖1L型鈣離子通道α1亞型蛋白和鉀離子通道Kv4.3蛋白表達檢測結果

討　　論

Wijffels等[1]于1995年利用快速起搏心房的方式成功制作了山羊房顫模型，發現隨著起搏時間延長AERP逐漸縮短，心房頻率適應性降低，證實了電重構參與房顫過程。并提出電重構的結果使房顫趨于自我維持的狀態，即房顫觸發房顫。電重構的特征主要包括：心房有效不應期縮短、頻率適應性降低、心房肌有效不應期離散度增加、心房傳導速度減慢、房顫易感性增加等。Yeh等[2]將起搏電極置于犬右心耳，以400 bpm快速起搏心房，分別測定起搏0 d、2 d、4 d、7 d時不同基礎起搏周長下的AERP，結果發現在起搏2 d后心房ERP大幅度降低，起搏4 d后ERP下降至基本穩定狀態，誘發房顫的持續時間由起搏前(10±7) s 延長至起搏后的數百秒，證明快速激動心房可引起電重構。另有研究[3]進一步評定了心房電重構發生的時限問題，發現房顫患者心房顫動超過10 min即可發生AERP的變化，但房顫終止后可迅速恢復。本研究結果顯示快速起搏心房8 h后測定不同基礎起搏周長下的AERP均顯著縮短，提示房顫模型制作成功。進一步延長起搏時間發現48 h內起搏組AERP在200 ms、150 ms的基礎起搏周長下持續降低，與起搏時間具有明顯正相關性，心房頻率適應性功能隨之惡化。

目前，國內外基于他汀類藥物的多效性，尤其是在房顫的上游治療中的作用進行了部分研究。ARMYDA-3研究首次證實擇期心臟手術前1周給予ATO可顯著減少術后新發房顫，使房顫發生危險降低61%并縮短住院時間[4]。但是有薈萃分析[5]稱他汀并不能降低電復律和藥物復律后的房顫復發。本研究中ATO預處理組可顯著抑制AERP的降低，并在一定程度上改善心房頻率適應性不良，有效改善心房電重構。在細胞水平上即表現為心房肌細胞上離子電流的變化，主要涉及L型鈣離子通道介導的ICaL和鉀離子通道介導的Ito，二者構成動作電位平臺期，參與細胞復極過程。已有研究指出細胞內鈣超載是誘發心房電重構的始動因素，并且可通過觸發負反饋機制,使得鈣離子通道失活,從而減少L 型鈣通道電流的電流密度,發生心房電重構和興奮收縮耦聯障礙[6]。Christian等[7]應用地高辛增加細胞內鈣離子濃度后，AERP降低程度明顯高于對照組，證實鈣超載是電重構的關鍵因素。細胞電生理研究發現在快速心房刺激模型中Ito電流密度明顯減少，起搏24 h后Ito和Kv4.3蛋白表達下降，同時進一步研究發現Ito在短期起搏后降低，但是長時間起搏后電流強度可逐漸恢復與對照組無明顯差異。Bosch 等[8]提出Kv4.3蛋白表達下降可能是Ito電流減少的可能機制，但并不是唯一機制，因為電流減少程度較蛋白表達下降更明顯。我們的研究應用Western blot法檢測左心房組織中L型鈣離子通道蛋白α1亞型CaLα1和鉀離子通道蛋白亞型Kv4.3，結果發現心房快速起搏48 h后組織中2 種蛋白含量明顯降低，而預先給ATO組可有效抑制通道蛋白表達量下降，且與心臟大小和心功能無關。

大量研究顯示炎癥、氧化應激是房顫發生的關鍵因素。動物房顫模型和臨床房顫患者的血清、心肌組織中炎性標志物均增加，實驗性抗炎治療有效。Pena等[9]報道C反應蛋白水平升高的患者隨機應用瑞舒伐他汀和安慰劑治療，瑞舒伐他汀組可明顯降低房顫風險。活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是氧化應激的重要標志物，研究發現房顫發生時NOX2/4活性增加，成為ROS的重要來源[10]。同時房顫導致線粒體發生腫脹、功能障礙，也可產生ROS。目前已有研究顯示ROS可直接或者間接調節細胞膜上的離子通道[11]，使鈣離子內流增加，導致鈣超載，因此抗氧化應激治療可減少鈣超載狀態、預防心房電重構[12]，而應用他汀治療可明顯降低ROS生成[13]，改善氧化應激狀態。另外他汀類藥物可通過調節細胞外金屬蛋白酶或其抑制劑的表達改善細胞外基質[14]，進而抑制房顫進展。

總之，本實驗發現，ATO預處理可明顯改善快速心房起搏誘導的兔心房電重構，進一步研究發現ATO可在一定程度上抑制心房肌鉀、鈣離子通道蛋白水平降低，這可能為ATO改善心房電重構的離子機制之一。ATO作為治療房顫的非傳統抗心律失常藥物有良好的應用前景。

[1]Wijffels MC, Kirchhof CJ, Dorland R, et al. Atrial fibrillation begets atrial fibrillation: a study in awake cronially instrumented goats[J]. Circulation, 1995, 92(7):1954-1968.

[2]Yeh YH, Qi X, Shiroshita-Takeshita A, et al. Atial tachycardia induces remodelling of muscarinic receptors and thier coupled potassium currrents in canine left atrial and pulmonary vein cardiomyocytes[J]. Br J Pharmacol, 2007, 152(7):1021-1032.

[3]Sticherling C, Oral H, Horrocks J, et al. Effects of digoxin on acute atrial refractoriness[J]. Circulation, 2000, 102(20):2503-2508.

[4]Patti G, Chello M, Candura D, et al. Randomized trial of atorvastatin for reduction of postoperative atrial fribrillation in patients undergoing cardiac surgery: results of the ARMYDA-3 (Atorvastatin for Reduction of MYocardial Dysrhythmia After cardiac surgery) study[J]. Circulation,2006, 114(14):1455-1461.

[5]Yang Q, Qi X, Li Y. The preventive effect of atorvastatin on atrial fibrillation: a meta-analysis of randomized controlled trials[J]. BMC Cardiovasc Disord, 2014, 14:99.

[6]馬瑞彥，楊宗英，鐘前進. 快速心房起搏對家兔L型鈣通道和鉀通道Kv4．3 mRNA與蛋白表達的影響心臟起搏研究[J]. 中華心血管病雜志, 2007, 12(35):1111-1115.

[7]Christian S, Hakan O, Julie H, et al. Effects of digoxin on acute, atrial fibrillation-induced changes in atrial refractoriness[J]. Circulation, 2000, 102(20):2503-2508.

[8]Bosch RF, Scherer CR, Rub N, et al. Molecular mechanisms of early electrical remodeling: transcriptional downregulation of ionchannel subunits reduces ICa，Land Itoin rapid atrial pacing in rabbits[J]. J Am Coll Cardiol, 2003, 41(5):858-869.

[9]Pena JM, MacFadyen J, Glynn RJ, et al. High-sensitivity C-reactive protein， statin therapy, and risks of atrial fibrillation: an exploratory analysis of the JUPITER trial[J]. Eur Heart J, 2012, 33(4):531-537.

[10]Kim YM, Kattach H, Ratnatunga C, et al. Association of atrial nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase activity with the development of atrial fibrillation after cardiac surgery[J]. J Am Coll Cardiol, 2008, 51(1):68-74.

[11]Wagner S, Rokita AG, Anderson ME, et al. Redox regulation of sodium and calcium handling[J]. Antioxid Redox Signal, 2013, 18(9):1063-1077.

[12]Liu T, Korantzopoulos P, Li G. Antioxidant therapies for the management of atrial fibrillation[J]. Cardiovasc Diagn Ther, 2012, 2(4):298-307.

[13]Watanabe T, Yasunari K, Nakamura M. Antioxidative actions of statins: potential mechanisms for antiathersclerotic effects[J]. Mini Rev Med Chem, 2006, 6(5):505-508.

[14]Marin F, Pascual DA, Roldan V, et al. Statins and postoperative risk of atrial fibrillation following coronary artery bypass grafting[J]. Am J Cardiol, 2006, 97(1):55-60.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effect of atorvastatin applied to atrial tachypacing rabbits on electrical remodeling

SONG Xue-lian, QI Xiao-yong, DANG Yi, LI Ying-xiao, YANG Qian

(DepartmentofCardiology,HebeiGeneralHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China.E-mail:hbghxiaoyong_q@126.com)

AIM: To investigate the effect of atorvastatin (ATO) on electrical remodeling, atrial ion channel protein expression and cardiac function in atrial tachypacing rabbits, and to explore the potential electrical mechanism of ATO in the prevention of atrial fibrillation. METHODS: The rabbits were subjected to atrial tachypacing at 600 min-1in the absence or presence of treatment with atorvastatin (ATP and ATO groups) for 48 h, and the other 10 as sham group without pacing (NP group). The tachypacing model was performed by attaching pacing and testing electrodes to left atrial and connecting with custom animal cardiac pacemaker in the open-chest situation. The animals in ATO group were pretreated with ATO for 7 d and continued during tachypacing. Serial atrial effective refractory period (AERP) was measured in each rabbit at baseline， 8 h, 16 h, 24 h, 32 h, 40 h and 48 h with different cycle lengths. The changes of cardiac functions and cardiac structure were observed by cardiac ultrasonic cardiogram before and after atrial tachypacing. The expression of atrial ion channel proteins CaLα1 and Kv4.3 was detected by Western blotting. RESULTS: Compared with NP group, AERP at cycle lengths of 150 and 200 ms, the adaption of AERP, and the levels of CaLα1 and Kv4.3 expression were all decreased in ATP and ATO group, especially in ATP group. Left atrial dimension (LAD) was increased in pacing groups as compared with NP group (P<0.05) after pacing delivery for 48 h, while no difference between the formers was observed. No significant change of the left ventricular dimension (LVD) and ejection fraction (LVEF) among groups before and after pacing was found. CONCLUSION: Atrial tachypacing significantly shorten AERP, resulting in poor adaption of AERP, while ATO pretreatment significantly attenuates the atrial electrical remodeling in rabbits, but had no effect on cardiac structure. ATO suppresses the down-regulation of atrial ion channel proteins CaLα1 and Kv4.3 expression after 48 h, which may be the potential ionic mechanism of atrial electrical remodeling for ATO.

Atrial fibrillation; Atorvastatin; Electrical remodeling

1000- 4718(2016)04- 0623- 05

2015- 11- 09

2016- 01- 25

Tel: 0311-85988937; E-mail: hbghxiaoyong_q@126.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.008

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