類幾丁質酶YKL-40及Toll樣受體4在慢性鼻竇炎伴鼻息肉與不伴鼻息肉患者中的表達差異

王海霞　石志堅

(石河子大學醫學院第一附屬醫院耳鼻喉科，新疆　石河子　832008)

?

類幾丁質酶YKL-40及Toll樣受體4在慢性鼻竇炎伴鼻息肉與不伴鼻息肉患者中的表達差異

王海霞石志堅

(石河子大學醫學院第一附屬醫院耳鼻喉科，新疆石河子832008)

目的探討類幾丁質酶YKL-40及Toll樣受體(TLR)4在慢性鼻竇炎伴鼻息肉與不伴鼻息肉患者中的表達差異。方法慢性鼻竇炎伴鼻息肉老年患者19例、不伴鼻息肉老年患者21例為研究組，取其竇口鼻道復合體黏膜；同期鼻中隔偏曲老年患者20例為對照組，取其下鼻甲黏膜。采用RT-PCR法檢測各組標本中YKL-40、TLR4及核因子(NF)-κB mRNA表達情況；免疫組化法檢測標本中YKL-40、TLR4蛋白表達強度。結果mRNA水平：伴鼻息肉組和不伴鼻息肉組類幾丁質酶YKL-40 mRNA表達均明顯高于對照組(P<0.05)；伴鼻息肉組和不伴鼻息肉組TLR4、NF-κB mRNA表達均明顯低于對照組(P<0.05)。不伴鼻息肉組YKL-40、TLR4之間無相關性(r=0.087，P>0.05)；伴鼻息肉組YKL-40與TLR4呈負相關(r=-0.852，P<0.05)。蛋白質水平：YKL-40在伴鼻息肉組的表達程度明顯高于不伴鼻息肉組(P<0.01)；不伴鼻息肉組與對照組YKL-40表達程度之間差異無統計學意義(P>0.05)。TLR4在伴鼻息肉組和不伴鼻息肉組表達均明顯低于對照組(P<0.01)；伴鼻息肉組與不伴鼻息肉組TLR4表達程度之間無統計學差異(P>0.05)。伴鼻息肉組YKL-40與TLR4蛋白質表達呈負相關(r=-0.571，P<0.05)；不伴鼻息肉組YKL-40與TLR4蛋白質表達無相關性(r=-0.251，P>0.05)。結論類幾丁質酶YKL-40在慢性鼻竇炎伴鼻息肉組織中高表達，且與TLR4呈負相關，提示二者存在交互作用，同時參與了慢性鼻竇炎伴鼻息肉的發生、發展。

慢性鼻竇炎；外源凝集素類；Toll樣受體4

慢性鼻竇炎患者鼻黏膜持續的炎癥刺激可導致鼻息肉，嚴重影響鼻腔通氣功能。老年患者抗應激能力較差，慢性鼻竇炎引起的通氣障礙能明顯提高患者死亡率〔1〕。類幾丁質酶YKL-40是人體中一個大分子糖蛋白，屬于幾丁質酶家族，但已失去水解酶活性，主要由中性粒細胞和巨噬細胞分泌。雖然YKL-40具體功能仍在探究中，但公認其為炎性標志物，與多種疾病的發病機制相關〔2〕。目前YKL-40在慢性鼻竇炎發病過程中的作用還少有報道。本研究擬探討YKL-40和Toll樣受體(TLR)4在老年慢性鼻竇炎伴鼻息肉與不伴鼻息肉患者鼻竇黏膜中的表達差異。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2014年1月至2015年6月間來本院耳鼻喉科就診的老年慢性鼻竇炎患者40例為研究組，其中伴鼻息肉19例，男10例、女9例，年齡60～75〔平均(66.31±3.80)〕歲；不伴鼻息肉21例，男12例、女9例，年齡60～73〔平均(65.58±3.69)〕歲。兩組研究標本取自患者竇口鼻道復合體黏膜。入選患者診斷均符合慢性鼻竇炎診斷和治療指南(2012年，昆明)標準，且2個月內未接受抗菌藥物、激素類藥物治療；慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者均為初發雙側鼻息肉。選取同期老年鼻中隔偏曲患者20例為對照組，男16例、女4例，年齡60～73〔平均(65.82±5.05)〕歲，研究標本取下鼻甲黏膜。各組患者年齡、性別構成之間差異無統計意義，入選患者均被告知研究信息，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本采集與處理新鮮組織標本離體后用生理鹽水洗凈表面的血液和組織液，均勻分成兩份，一份放入無菌試管中，-80℃超低溫保存；另一份用10%甲醛溶液固定保存。

1.2.2反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)取低溫凍存的組織標本，Trizol法提取標本中的總RNA，按試劑盒(上海研拓生物科技有限公司)說明反轉錄得到cDNA。RT-PCR檢測標本中YKL-40、TLR4、核轉錄因子-κB(NF-κB)的mRNA相對表達量。10 μl反應體系包塊反轉錄獲得的cDNA 0.5 μl，濃度10 μmol/L的正、反引物0.5 μl，引物設計由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成，Real Master Mix(SYBR Green)試劑5 μl，去離子水4 μl。連續反應40個循環，根據每孔的Ct值進行分析。

1.2.3免疫組化檢測檢測標本中YKL-40、TLR4蛋白含量。取10%甲醛溶液固定的組織標本，常規脫水，石蠟包埋，4 μm切片。放入烘干機15 min后轉至50℃烤箱中30 min。在枸櫞酸鹽溶液中行熱修復20 min。鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P)二步法進行染色。兔抗人YKL-40、TLR4抗體工作濃度均為1∶300，4℃濕盒中孵育過夜。二氨基聯苯胺(DAB)溶液顯色，光鏡下觀察染色到適度終止，蘇木素復染，封片。以試劑公司提供圖片為陽性對照，磷酶鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對照，排除非特異性著色。結果由兩名病理學研究員雙盲獨立評分，判定標準參照Kamba等〔3〕研究。

1.3統計學方法應用SPSS18.0軟件進行方差分析、t檢驗、χ2檢驗及Spearman相關性分析。

2　結　果

2.1YKL-40、TLR4、NF-κB的mRNA表達情況和相關性分析三組患者YKL-40、TLR4、NF-κB的mRNA表達水平均有統計學差異(F=5.691、8.726、4.253，P<0.05)。伴鼻息肉組和不伴鼻息肉組YKL-40 mRNA表達均明顯高于對照組(P<0.05)；伴鼻息肉組和不伴鼻息肉組TLR4、NF-κB mRNA表達均明顯低于對照組(P<0.05)。不伴鼻息肉組YKL-40、TLR4之間無相關性(r=0.087，P>0.05)；伴鼻息肉組YKL-40與TLR4呈負相關(r=-0.852，P<0.05)；對照組YKL-40、TLR4之間無相關性(r=0.014，P>0.05)。見表1。

表1　三組患者YKL-40、TLR4、NF-κB mRNA表達情況比較±s)

與對照組相比：1)P<0.05

2.2YKL-40、TLR4蛋白質表達水平相關性分析YKL-40、TLR4蛋白主要表達于鼻竇黏膜的上皮細胞、下腺體細胞和炎性細胞中，表達位置基本一致。YKL-40陽性染色主要位于細胞質，而TLR4陽性染色主要位于細胞質和細胞膜。見圖1。

圖1　YKL-40、TLR4蛋白在各組患者鼻黏膜組織中的表達(×200)

YKL-40在伴鼻息肉組的表達程度明顯高于不伴鼻息肉組(P<0.01)；不伴鼻息肉組與對照組YKL-40表達程度之間無統計學差異(P>0.05)。TLR4在伴鼻息肉組和不伴鼻息肉組表達均明顯低于對照組(P<0.01)；伴鼻息肉組與不伴鼻息肉組TLR4表達程度之間無統計學差異(P>0.05)。伴鼻息肉組YKL-40與TLR4蛋白質表達呈負相關(r=-0.571，P<0.05)；不伴鼻息肉組YKL-40與TLR4蛋白質表達無相關性(r=-0.251，P>0.05)。見表2。

表2　三組患者YKL-40、TLR4蛋白質表達水平分布(n)

3　討　論

盡管目前關于慢性鼻竇炎伴鼻息肉與不伴鼻息肉的發病機制存在超抗原、細菌生物膜、變態反應等多種假說，但具體發病機制仍未明確。相關研究顯示，炎性腸病、哮喘患者的血清中存在YKL-40蛋白表達水平升高現象，且與病情進展密切相關，還可能同時合并慢性鼻竇炎且傾向伴鼻息肉的表型〔4〕。本次研究結果說明YKL-40可能參與了慢性鼻竇炎伴鼻息肉的發生、發展。相關研究顯示，慢性鼻竇炎不伴鼻息肉以輔助T細胞(Th1)反應為主，伴息肉以Th2反應為主，且YKL-40可能以黏蛋白細胞因子形式影響Th2反應〔5〕。本次研究中進一步證實了在蛋白質水平上慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者YKL-40表達明顯強于不伴鼻息肉患者，雖然兩組在mRNA水平上差異無統計學意義，但存在表達差異的趨勢。說明YKL-40表達差異可能為慢性鼻竇炎不同表型的原因之一。

骨骼肌細胞的研究已證實，YKL-40高表達會抑制NF-κB相關信號傳導通路，而NF-κB作為核轉錄因子的一種，能夠在轉錄水平上對多種炎性因子表達進行調節，且NF-κB參與的信號傳導通路在多種自身免疫性疾病的發生、發展中起到重要作用，同時其在慢性鼻竇炎發病中的作用也受到關注〔6〕。本次研究顯示，伴鼻息肉組患者YKL-40高表達時，NF-κB低表達，提示YKL-40可能通過影響NF-κB通路而參與慢性鼻竇炎伴鼻息肉的發生，具體分子機制仍需深入研究。

TLR4作為Toll樣受體的一種亞型，在氨基酸序列下游信號傳導中具有重要作用。當配體蛋白與其胞外受體相結合時，可誘導生成下游低聚蛋白復合體，影響炎性反應〔7〕。相關研究顯示，TLR4激活能夠增強NF-κB通路活性，促進下游白細胞介素(IL)-8、環氧酶(Cox)-2炎性因子表達，增強炎性反應，但具體分子機制尚未明確〔8〕。本次研究中對TLR4進行檢測，結果提示在慢性鼻竇炎中TLR4通過影響NF-κB通路參與病情發生。

綜上所述，本次研究證實了慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者中存在YKL-40高表達和TLR4、NF-κB低表達，且YKL-40與TLR4之間呈明顯負相關，因此可認為YKL-40、TLR4共同作用于NF-κB信號通路，參與慢性鼻竇炎伴鼻息肉的發生。

1孫紹輝，趙松花，朱奇，等.鼻內鏡下治療老年慢性鼻竇炎、鼻息肉的療效分析〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(7)：1667-9.

2Murad S.Tol-like receptor4 in inflammation and angiogenesis：a double edged sword〔J〕.Front Immunol，2014；5(2)：313.

3Kamba A，LeeI A，Mizoguchi E.Potential association between TLR4 and chitinase3-like1(CHl3L1/YKL-40)signaling on colonic epithelial cells in inflammatory bowel disease and colitis-associated cancer〔J〕.Curr Mol Med，2013；13(7)：1110-21.

4李昕輝，滕飛.白細胞介素23基因沉默對支氣管哮喘小鼠的影響〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2015；16(1)：38-42.

5隋麗，陳冬，馬曉峰，等.老年慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者外周血嗜酸性粒細胞與肺功能的相關性〔J〕.中國老年學雜志，2014；34(10)：2629-31.

6Guilemany JM，Alobid I，Mullol J.Controversies in the treatment of chronic rhinosinusitis〔J〕.Exp Rev Respir Med，2010；4(4)：463-77.

7Srivastava SK，Antal P，Gall J，etal.Lack of evidence for association of two functional SNPs of CHI3L1 gene(HC-gp39) with rheumatoid arthritis〔J〕.Rheumatol Int，2011，31(8)：1003-7.

8陳黛詩.高遷移率族蛋白1在慢性鼻竇炎伴鼻息肉中的表達及作用機制〔D〕.北京：中國人民解放軍軍醫進修學院，2013.

〔2015-12-13修回〕

(編輯袁左鳴)

新疆維吾爾自治區科技援疆計劃(No.2014Z91172)

王海霞(1969-)，女，主管護師，主要從事耳鼻喉科研究。

R76

A

1005-9202(2016)17-4285-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.075