人乳頭瘤病毒16亞型LAMP檢測法的建立

薛德冬　張　靜　高麗娜　梁　迪

(山東省勝利油田醫院藥劑科，山東　東營　257055)

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人乳頭瘤病毒16亞型LAMP檢測法的建立

薛德冬張靜1高麗娜2梁迪3

(山東省勝利油田醫院藥劑科，山東東營257055)

目的本研究旨在建立一種簡單、快速、靈敏的檢測方法，使環介導等溫擴增技術(LAMP)應用于HPV16亞型的檢測。方法根據GenBank登錄的HPV16亞型序列(FJ610152)中E7基因序列設計了多套特異引物，通過LAMP real-time Turbidimeter儀對HPV16亞型的LAMP引物進行篩選并對反應體系和反應條件進行檢測和實時監控以檢測其特異性和敏感性。反應結束后加入SYBR Green I染料肉眼判定并與儀器檢測結果進行比對。結果建立的LAMP方法在61℃下可對HPV16核酸進行高效擴增，反應結束后加入染料肉眼判定結果與Real-time Turbidimeter儀檢測結果一致；該方法具有較強的特異性和較高的敏感性(最低檢出限量為3.0×103 copies/μL)。LAMP法與HPV分型試劑盒對35份樣品的檢測結果一致。結論本研究建立的可視化LAMP方法操作簡便，適用于HPV16的快速檢測。

人乳頭瘤病毒；環介導等溫擴增技術

人乳頭瘤病毒(HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亞科的一種小型雙鏈環狀DNA 病毒。HPV 感染能引起宮頸癌、生殖器疣等多種性傳播疾病，每年因感染HPV致癌死亡人數居高不下，HPV已成為潛在的隱形殺手，嚴重危害人類健康〔1，2〕。HPV主要分為高危型和低危型，報道高危型HPV16相關宮頸癌早期診斷率低，宮頸癌癌前病變進程更快，HPV16也是宮頸癌再發的獨立危險因素〔3〕，感染HPV16或HPV18的女性，其病程發展至宮頸癌前病變的風險遠高于未感染者〔4〕。另據研究表明，宮頸癌患者中70%由高危型HPV16和18感染引起，因此對HPV高危型的及時檢測對于在宮頸癌未發生前做出積極治療具有現實意義。環介導等溫擴增技術(LAMP)為Notomi于2000年發明的新型檢測技術〔5〕，其原理是針對六個不同區域設計了4條引物對核酸進行恒溫擴增，現已被廣泛應用到病毒、細菌、寄生蟲等領域。SYBR Green I是一種雙鏈DNA染料，當結合了DNA雙鏈時即可發出熒光，利用此特性建立可視化的環介導等溫擴增技術使結果更加一目了然。本試驗針對HPV 16 E7基因設計了4條特異性引物(F3、B3、FIP、BIP)，恒溫下對HPV16進行擴增，通過LA-320型LAMP Real-time Turbidimeter儀對反應進程進行監測建立環介導等溫擴增方法，旨在為基層醫院預防宮頸癌做出貢獻。

1　材料與方法

1.1材料DNA LAMP Kit、LA-320型LAMP Real-time Turbidimeter儀購自日本榮源株式會社；Multiskan spectrum紫外分光光度計；SYBR Green I購自Invitrogen公司；12份已知的單重感染12不同HPV亞型的宮頸刮片樣本及35份未知的宮頸刮片臨床樣本來自長春市人民醫院，患者年齡為25～47歲。樣本均為專用宮頸刷收集的宮頸分泌物，12份單重感染HPV亞型的臨床樣品由廣東凱普HPV分型試劑盒確認。

1.2LAMP引物設計采用Primer Explorer V4軟件，根據GenBank登錄的HPV16亞型序列(FJ610152)中E7基因設計多套特異引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。經初步篩選后得到一套效果最佳引物，見表1。

表1　HPV16亞型LAMP檢測引物序列

1.3HPV基因片段合成和純化及定量以Qiagen DNA提取試劑盒提取HPV6亞型宮頸刮片樣本DNA為模板，以HPV LAMP引物的外引物F3和B3為PCR的引物進行PCR擴增，反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環35次；末次循環72℃延伸5 min。擴增產物經回收后克隆至pMD18-T載體，轉化至感受態細胞DH5α中后置于氨芐抗性的LB固體培養基中37℃培養12～16 h，藍白斑篩選重組質粒pMD18-T-HPV16，挑取白斑進行菌落PCR，采用Omega Biotek質粒小量提取試劑盒I型提取重組質粒，用紫外分光光度計測定其濃度。

1.4LAMP檢測HPV特異性按Qiagen DNA提取試劑盒說明書分別提取單重感染的12種不同HPV亞型(HPV6、11、42、43、16、18、26、31、51、52、53、56)的宮頸刮片樣本DNA為模板，建立如下體系：5 μl DNA樣本、12.5 μl 2×反應緩沖液(RM)、2 μl FIP (10 pmol/μl)、2 μl BIP (10 pmol/μl)、0.5 μl F3 (10 pmol/μl)、0.5 μl B3(10 pmol/μl)、1 μl Bst DNA聚合酶 (EM)、去離子水(DW)補充至25 μl。混勻后置于LA-320型LAMP Real-time Turbidimeter儀內61℃恒溫擴增。見圖1，圖2。記錄擴增曲線圖，待反應結束后添加SYBR Green I 5 μl，肉眼觀察陽性管內液體顏色熒光情況，檢測LAMP方法的特異性。

1.5LAMP檢測HPV靈敏度將1.3提取的質粒經紫外分管光度計測定的濃度記錄，換算為拷貝數并依次10倍倍比稀釋，依次為3×107、3×106、3×105、3×104、3×103、3×102、3×101、3×100copies/μl，LAMP檢測體系同上。

1.6LAMP與HPV分型試劑盒檢測宮頸刮片標本按Qiagen試劑盒說明書提取35份未知宮頸刮片樣本DNA，分別進行LAMP和HPV分型試劑盒檢測，比較二者結果。

2　結　果

2.1LAMP檢測HPV16亞型特異性對12份已知的單重感染12種不同亞型(其中HPV6、11、42、43為低危型，HPV16、18、26、31、51、52、53、56為高危型)的樣品DNA進行LAMP擴增，見圖1，圖2。結果顯示：當溫度到達61℃時，35 min后僅HPV16亞型為陽性，其他試驗樣品均為陰性。圖3為反應結束后加入5 μl SYBR Green Ⅰ后管內顏色情況，橙黃色為陽性，鐵銹色為陰性，可視化結果與圖1、圖2結果一致。

1: HPV6；2：HPV11；3：HPV42；4：HPV43；5：HPV16；6：HPV18；7：HPV26；8：HPV31圖1　HPV6亞型LAMP特異性試驗Real-time Turbidimeter分析圖

1: HPV51；2：HPV52；3：HPV53；4：HPV56；5：陰性對照圖2　HPV16亞型LAMP特異性試驗Real-time Turbidimeter分析圖

1～13：HPV6、HPV11、 HPV42、 HPV43、 HPV16、 HPV18、 HPV26、 HPV31、 HPV51、 HPV52、 HPV53、 HPV56、陰性對照圖3　HPV16亞型LAMP特異性試驗可視化圖

2.2LAMP檢測HPV6型靈敏度結果顯示，建立的LAMP體系檢測方法最低檢測濃度為3×103copies/μl，待反應結束后加入5 μl SYBR Green I后管內顏色情況(圖4)與Real-time Turbidimeter儀檢測結果一致(圖5)，表明該方法有較高敏感性。

1～8：2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×101、2×100 copies/μl圖4　HPV16亞型LAMP敏感性試驗可視化圖

CH1～8：3×107、3×106、3×105、3×104、3×103、3×102、3×101、3×100 copies/μl圖5　HPV16亞型LAMP敏感性試驗real-time Turbidimeter分析圖

2.3LAMP與凱普HPV分型試劑盒檢測宮頸刮片標本的結果對比對長春市中心醫院提供的35份宮頸刮片臨床標本進行LAMP檢測和凱普分型試劑盒檢測，LAMP方法共檢測出10份HPV16亞型感染樣本，25份陰性樣本，凱普HPV分型試劑盒共檢測出10份HPV16亞型感染樣本，17份陰性和8份其他HPV亞型感染樣本。二者檢測結果一致且不存在交叉反應，說明本研究建立的HPV16亞型LAMP檢測方法適用于臨床檢測。

3　討　論

目前已有100多種HPV亞型被鑒定，其中約40余種與人類生殖器皮膚薪膜病變有關。根據其對生殖系統的致癌性，可將其分為低危型和高危型，前者包括HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81等，以HPV6最為常見，主要引起尖銳濕疣等良性病變；后者包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、72、82等〔6〕，其中以HPV16、18最為常見，常引起惡性病變，如宮頸癌〔7～9〕。由于HPV的致病性與其亞型密切相關，所以對其進行檢測和分型對于臨床診斷具有重要意義。

本研究基于顏色判定的LAMP技術對HPV16亞型E7基因設計四條特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶恒溫條件下完成擴增，比其他檢測方法節省時間且敏感性高。反應中對HPV16亞型進行了檢測，通過對其他12種不同亞型的臨床樣

本進行特異性分析，61℃恒溫擴增后僅HPV16為陽性，其他均為陰性，待反應結束后加入SYBR Green I〔10〕后可視化結果與LAMP real-time Turbidimeter LA-320儀結果一致，敏感性試驗表明本研究建立的LAMP檢測方法最低檢出限量為3.0×103copies/μl，具有較強的敏感性，之后對35份未知的宮頸刮片臨床樣品進行了臨床檢測，證明了本方法特異性強且無交叉反應。

宮頸癌的前期病變是一個相對較長的時間過程，在診斷后進行干預治療是預防宮頸癌發生、發展的重要手段，因此宮頸癌的診治是防癌變的重要內容。本研究著重針對高危型HPV16建立了可視化的LAMP檢測方法，利用LAMP real-time Turbidimeter LA-320儀針對HPV反應進程進行實時監控在國內尚屬首次，HPV16核酸在61 ℃的恒溫條件下反應35 min，即可判定結果，反應結束后在擴增產物中加入了SYBR Green Ⅰ實現了LAMP的可視化，結果更為直觀，本方法具有操作簡便、敏感性高、成本低廉的特點，為基層醫院檢測帶來方便，為HPV的快速檢測提供了一種新的途徑。

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2Schiffman M，Wentzensen N，Wacholder S，etal.Human papillomavirus testing in the prevention of cervical cancer〔J〕.J Natl Cancer Inst，2011;103(5)：368-83.

3段蒙，陳秀杰，曲芃芃.人乳頭瘤病毒16型感染及其高危因素分析〔J〕.天津醫藥，2015;43(4):379-82.

4堯榮鳳，趙旭鴻，李智.不同年齡段女性人乳頭瘤病毒感染狀況分析〔J〕.檢驗醫學，2014;29(7):708-11.

5Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，etal.Loop-mediated is other-mad amplification of DNA〔J〕.Nucleic Acids Res，2000;28(12)：63.

6曲守方，孫彬裕，于婷，等.人乳頭瘤病毒核酸(分型)檢測試劑(盒)行業標準的驗證實驗〔J〕.藥物分析雜志，2013;33(12)：2039-42.

7趙愛華，張紅華.多重人乳頭瘤病毒感染與宮頸癌及癌前病變的相關性研究〔J〕.寧夏醫學雜志，2009;31：684-6.

8陶萍萍，卞美璐，李敏，等.HPV 多重感染與宮頸病變關系探討〔J〕.中國婦產科臨床雜志，2006;7：94-6.

9王長奇，王康，陳燕萍，等.HPV 多重感染與宮頸病變關系的分析〔J〕.實驗與檢驗醫學，2012;30：166-8.

10Iwamoto T，Sonobe T，Hayash IK.Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of micro bacterium tuberculosis complex，M.avium，and M.intracellulare in sputum samples〔J〕.J Clin Microbiol，2003;41(6)：2616-22.

〔2015-12-18修回〕

(編輯袁左鳴)

梁迪(1979-)，男，博士，講師，主要從事生物化學研究。

薛德冬(1978-)，男，主管藥師，主要從事臨床藥學、醫院藥學方面研究。

R3

A

1005-9202(2016)17-4180-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.020

1吉林大學第二醫院藥品管理部

2吉林大學第二醫院婦產科3吉林大學藥學院