白細胞介素-18對分泌性中耳炎大鼠耳腔灌洗液中干擾素-γ和白細胞介素-4表達的影響

曲　莉

(南陽市中心醫院耳鼻喉二病區，河南　南陽　473000)

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白細胞介素-18對分泌性中耳炎大鼠耳腔灌洗液中干擾素-γ和白細胞介素-4表達的影響

曲莉

(南陽市中心醫院耳鼻喉二病區，河南南陽473000)

目的探討白細胞介素(IL)-18對分泌性中耳炎(OME)大鼠耳腔灌洗液中干擾素(IFN)-γ和IL-4表達的影響。方法選取30只成年雄性SD大鼠，按隨機數字表法分為對照組、OME模型組(模型組)和IL-18處理組(觀察組)，各10只。參照Hardy的方法對模型、觀察組大鼠腹腔注射卵清蛋白(OVA)致敏后耳內激發制成OME模型，對照組大鼠于相同時間點分別腹腔注射氫氧化鋁溶液及磷酸鹽緩沖液(PBS)。同時觀察組于第1、2、7、8、15、16天腹腔注射IL-18溶液(1 μg溶于0.2 ml生理鹽水)，對照、模型組同期腹腔注射0.2 ml生理鹽水。第18天于耳鏡下觀察鼓膜像表現，光鏡下觀察中耳組織的病理學改變，ELISA法測定大鼠耳腔灌洗液中IFN-γ和IL-4的水平。結果(1)模型、觀察組中耳內呈現炎癥反應，觀察組炎癥較模型組有所減輕；(2)三組嗜酸性粒細胞、中性粒細胞及肥大細胞計數比較，模型組三種細胞數均多于對照組，觀察組嗜酸性粒細胞和中性粒細胞數多于對照組，中性粒細胞和肥大細胞數多于模型組(P<0.05)，其他兩兩比較無差異(P>0.05)；(3)模型、觀察組大鼠的IFN-γ與IL-4水平均顯著高于對照組，且觀察組的IFN-γ水平高于模型組(P<0.05)，而模型、觀察組IL-4水平無差異(P>0.05)，模型組的Th1/Th2比值顯著低于對照、觀察組(P<0.05)，對照、觀察組無差異(P>0.05)。結論IFN-γ和IL-4共同參與OME的發生發展過程，IL-18可通過上調IFN-γ和IL-4的表達，調控Th1/Th2的平衡狀態而抑制OME的進展。

分泌性中耳炎；白細胞介素18；干擾素γ；白細胞介素4

分泌性中耳炎(OME)是中耳非化膿性炎性疾病，病因是咽鼓管的機械性阻塞和功能障礙〔1〕。Th2/Th1細胞失衡是造成OME發生的重要因素〔2〕。白細胞介素(IL)-4和干擾素(IFN)-γ作為Th2和Th1分泌的細胞因子，在OME發生發展中發揮重要作用。IL-18可誘導IFN-γ的產生和T細胞增殖〔3〕，改善OME患者中耳Th2/Th1細胞失衡狀態。本研究旨在探討IL-18對OME的免疫調節機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物選取30只SPF級成年雄性SD大鼠(購自鄭州大學醫學院實驗中心)，體質量250～300 g，均由耳窺鏡檢查證實無外耳道及中耳感染。于動物實驗室自由進食喂養，室溫(21.0±3.0)℃，濕度50%～75%，自然光照，適應性喂養1 w。

1.1.2主要儀器與試劑(1)儀器：酶標儀(美國Thermo)；電子顯微鏡(日本OLYMPUS)(2)試劑：卵清蛋白(OVA，Ⅴ級，美國Sigma公司)；IL-18(美國R&D公司)ELISA試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)

1.2研究方法

1.2.1動物分組與OME模型制備采用隨機數字表法將30只大鼠隨機分為對照組、OME模型組和IL-18處理組(觀察組)，每組10只。參照Hardy等〔4〕的方法制備OME模型，取1.2 mg OVA溶于0.6 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，再取5.14 mg氫氧化鋁溶于0.6 ml PBS作為免疫佐劑，震蕩均勻，行腹腔注射，第8天行第二次注射，造成全身致敏；于第15天用10%的水合氯醛以15 mg/kg體重的劑量麻醉大鼠，將0.1 mg OVA溶于35 μl PBS中，以微量進樣器于手術顯微鏡下由鼓膜注入，第16天麻醉后觀察耳內鏡下的鼓膜情況，并注射第2次，形成耳內激發狀態，此時OME模型制備完成。模型制備成功表現為鼓膜呈明顯內陷、紅斑，部分可見液平面及中耳內氣泡。對照組大鼠處理方法：取5.14 mg氫氧化鋁溶于1.2 ml PBS中，于全身致敏階段注入腹腔，并于耳內激發階段注入等量PBS。

1.2.2處理方法〔3〕觀察組進行OME造模同時于第1、2、7、8、15、16天腹腔注射IL-18(取1 μg溶于0.2 ml生理鹽水)，對照、模型組同期腹腔注射0.2 ml生理鹽水。

第18天時麻醉大鼠，于耳鏡下觀察鼓膜像表現，斷頭處死，將雙側中耳腔以50 μl PBS液進行3次灌洗，收集150 μl灌洗液，于4℃ 離心機中以4 000 r/min轉速離心10 min，將上清液置于-80℃冰箱中保存。取雙側中耳組織固定于4%的多聚甲醛中，脫鈣、脫水，行常規石蠟包埋、切片。

1.3觀察指標

1.3.1大鼠中耳黏膜組織病理學改變常規蘇木素-伊紅(HE)染色，于光鏡下觀察中耳及咽鼓管的病理變化，隨機選擇細胞數多的5個高倍鏡視野，計數嗜酸性粒細胞，甲苯胺藍染色計數肥大細胞。

1.3.2灌洗液中IFN-γ和IL-4的表達采用ELISA試劑盒測定三組大鼠中耳灌洗液中的IFN-γ和IL-4水平。首先以標準品進行標準曲線的繪制，后采用酶標儀于450 nm波長下測定樣品吸光度值，計算其濃度。

1.4統計學方法應用SPSS14.0軟件，三組正態分布計量資料行單因素方差分析，兩兩均數的比較采用SNK-q檢驗。

2　結　果

2.1耳鏡下大鼠鼓膜像的改變對照組鼓膜像大致正常，呈現少量放射狀血管紋；模型、觀察組大鼠耳膜及周圍組織均可見充血，及放射狀擴張的血管紋，出現明顯內陷及紅斑，部分標本可見液平面及氣泡，觀察組鼓膜鏡像較模型組炎癥程度有所減輕。

2.2大鼠中耳黏膜組織病理學改變對照組大鼠中耳內組織病理學觀察可見，纖毛上皮呈輕度腫脹，纖毛結構正常且排列整齊；模型、觀察組耳黏膜明顯增厚，毛細血管擴張，纖毛上皮明顯腫脹且排列紊亂，部分纖毛脫落，黏膜下層及骨髓腔中可見大量中性粒細胞、嗜酸性粒細胞及淋巴細胞，咽鼓管周圍肥大細胞明顯增多；觀察組炎癥表現較模型組有所減輕。模型組三種細胞數均多于對照組，觀察組嗜酸性粒細胞和中性粒細胞數多于對照組，中性粒細胞和肥大細胞數多于模型組(P<0.05)，其他兩兩比較無差異(P>0.05)。見表1。

2.3三組大鼠耳腔灌洗液中IFN-γ和IL-4的表達模型、觀察組IFN-γ與IL-4水平均顯著高于對照組，且觀察組的IFN-γ水平高于模型組(P均<0.05)，而模型、觀察組IL-4水平比較無差異(P>0.05)；模型組的Th1/Th2比值顯著低于對照、觀察組(P<0.05)，而對照、觀察組比較無差異(P>0.05)。見表2。

表1　三組大鼠中耳組織切片細胞計數比較±s)

與對照組相比：1)P<0.05；與模型組相比：2)P<0.05

表2　三組大鼠耳腔灌洗液中IFN-γ和IL-4的表達

3　討　論

“Th2/Th1失衡假說”認為，正常機體內Th1、Th2細胞及其細胞因子處于動態平衡狀態，共同維持機體的免疫自穩，若平衡失調，機體將啟動一系列免疫病理反應，產生疾病〔5〕。Th1和Th2為CD4+T輔助細胞在抗原等刺激作用下產生的兩種亞群的效應細胞，均來自一個共同的前體細胞Th0，二者在免疫系統中功能各異。其中Th1細胞主要增強吞噬細胞介導的抗感染免疫，其分泌的IFN-γ是巨噬細胞活化必不可少的細胞因子；Th2細胞分泌IL-3、IL-4等大量細胞因子，且誘導B淋巴細胞合成高水平的抗原特異性IgE，主要參與第1型自體免疫疾病，在IgE和嗜酸性粒細胞介導的炎性反應中發揮重要作用〔6〕，兩者共同作用與調控維持機體的正常免疫狀態。而一旦二者比例失衡，將造成機體的免疫紊亂狀態，有研究發現，Th2/Th1失衡與鼻炎、變應性哮喘、宮頸癌等疾病的發生有關〔7～9〕。其與OME的相關關系亦受到學者的廣泛關注，劉華等〔3〕研究發現，中耳在各種刺激下可造成Th細胞分化偏移，發生Th2反應，造成粘膜上皮損傷，黏液分泌增加，中耳滲液增加及調節功能下降。因此，如何上調Th1反應及抑制Th2反應成為糾正OME的關鍵。IL-18為一種由巨噬細胞分泌的多效能的免疫調節因子，有研究表明其對先天性免疫及Th1/Th2免疫反應具有調控作用〔10〕，其對OME的調節作用及相關機制仍待深入探討。本研究結果表明Th1和Th2細胞參與大鼠OME的發生發展過程，大鼠中耳組織在外源性刺激下，IFN-γ和IL-4表達增多，大量激活Th1和Th2細胞的分泌，介導免疫反應的發生，從而使嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和肥大細胞等免疫細胞增多。與以往研究結果〔3〕相符。此外，IL-18可抑制OME的持續進展，說明其作用機制可能為：IL-18可單獨產生或通過與IL-12、IL-2的協同作用誘導產生IFN-γ，上調Th1反應，同時IL-18通過持續激活Th2細胞，維持IL-4的過量分泌，從而發揮Th1/Th2免疫反應的雙重調節作用，共同作用使Th1/Th2比值上調，從而調控OME的進展。而另外也有研究指出IL-18可使自然殺傷(NK)細胞的毒性顯著增強〔11〕，影響FasL/Fas介導的細胞凋亡，導致OME大鼠的免疫功能紊亂和OME的持續存在，這可能是IL-18對OME的另一種作用機制，對其具體作用方式和調控機制有待深入研究。

1楊琳,趙守琴.分泌性中耳炎發病機制的研究進展〔J〕.聽力學及言語疾病雜志,2014;22(3):328-31.

2李賢斌,吳海麗,肖艷林.IL-4和IFN-γ在分泌性中耳炎患者外周血及中耳積液中的表達及意義〔J〕.海南醫學院學報,2014;20(12):1604-6.

3劉華,趙守琴,高占梅,等.IL-18對分泌性中耳炎模型大鼠中耳IFN-γ和IL-4表達的影響〔J〕.聽力學及言語疾病雜志,2014;22(1):76-80.

4Hardy SM,Heavner SB,White DR,etal.Late-phase allergy and eustachian tube dysfunction〔J〕.Otolaryngol Head Neck Surg,2001;125(4):339-45.

5苗紅玲,于海玲,孫美紅,等.兒童腺樣體肥大程度與分泌性中耳炎發生的相關性研究〔J〕.現代生物醫學進展,2014;14(11):2083-7.

6Fukuda K,Nishida T,Fukushima A.Synergistic induction of eotaxin and VCAM-1 expression in human corneal fibroblasts by staphylococcal peptidoglycan and either IL-4 or IL-13〔J〕.Allergol Int,2011;60(3):355-63.

7張仲林,鐘玲,袁明勇,等.Th1/Th2/Th17/Treg細胞因子在變應性鼻炎發病中的免疫機制研究〔J〕.醫學綜述,2014;20(16):2906-9.

8曾雪妮.過敏性哮喘的皮下特異性免疫治療:CD4+～CD25+～Foxp3+～Treg細胞和Th1/Th2細胞的變化及速發不良反應分析〔D〕.廣州：廣州醫科大學,2014.

9袁芳.Th1/Th2和Th17/Treg平衡失調與宮頸癌發生發展關系及術后CD_4～+淋巴細胞亞群的改變〔D〕.濟南：山東大學,2014.

10Zhang L,Hao CQ,Miao L,etal.Role of Th1/Th2 cytokines in serum on the pathogenesis of chronic hepatitis C and the outcome of interferon therapy〔J〕.Genet Mol Res,2014;13(4):9747-55.

11Inoue Y,Abe K,Onozaki K,etal.TGF-β decreases the stability of IL-18-induced IFN-γ mRNA through the expression of TGF-β-induced tristetraprolin in KG-1 cells〔J〕.Biol Pharm Bull,2015;38(4):536-44.

〔2015-12-31修回〕

(編輯袁左鳴)

曲莉(1980-)，女，碩士，主治醫師，主要從事耳鼻喉疾病方面的研究。

R76

A

1005-9202(2016)17-4176-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.018