吡柔比星脂質體制備與表征及其體外抗腫瘤作用

王學菊　程少會　高立明　鄭　磊　邸　婭　付占昭　姜　麗　徐紅梅　王麗萍

(吉林大學中日聯誼醫院病理科，吉林　長春　130033)

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吡柔比星脂質體制備與表征及其體外抗腫瘤作用

王學菊程少會1高立明1鄭磊1邸婭1付占昭1姜麗1徐紅梅1王麗萍

(吉林大學中日聯誼醫院病理科，吉林長春130033)

目的構建吡柔比星脂質體，提高吡柔比星的生物利用度和抑瘤作用，降低其毒副作用。方法采用薄膜水化法制備吡柔比星脂質體，并測定其包封率和物理性狀。構建乳腺癌細胞U14的荷瘤裸鼠模型，分別尾靜脈注射吡柔比星裸藥及吡柔比星脂質體，分析其抑瘤作用。結果薄膜水化法制備的吡柔比星脂質體平均粒徑(140.9±2.36)nm，多分散系數為(0.203±0.01)，Zeta電位為-(14.2±2.64)mV，包封率為(75.1±3.5)%，并且可以緩釋吡柔比星；吡柔比星脂質體組抑瘤率(75.1±8.6)%高于吡柔比星裸藥組(64.9±12.2)%。結論吡柔比星脂質體是很有潛力的抗腫瘤納米藥物。

吡柔比星;脂質體;包封率；薄膜水化法；抑瘤率

脂質體作為藥物載體，具有靶向性、降低藥物毒性、減少藥物劑量等優點，因此脂質體作為藥物載體被重視并得到了廣泛應用〔1～3〕。脂質體作為抗癌藥物載體能增加與癌細胞的親和力，且能夠增加藥物被癌細胞的攝取量，克服耐藥性，降低用藥量，提高療效，降低毒副作用。由于脂質體的功能不同，脂質體可分為傳統脂質體、隱身脂質體、長循環脂質體，免疫脂質體等〔4〕。目前制備脂質體常規的方法有薄膜分散法、逆向蒸發法、表面活性劑除去法、乙醇注入法、乳化法以及pH梯度法、硫酸銨梯度法等〔5〕。吡柔比星主要用于治療的惡性腫瘤包括白血病、乳腺癌、子宮癌、卵巢癌和肺癌等〔6〕。吡柔比星為紅色無臭粉末，其油水分配系數Log P為4.102(參考值)，脂溶性好，能溶于乙醇和甲醇等溶劑，但其有累積性心臟毒性〔7〕、骨髓抑制、嚴重胃腸道反應毒副作用〔8〕。本文采用薄膜水化法制備吡柔比星脂質體，降低吡柔比星的毒副作用并提高通過其生物利用度，測定吡柔比星脂質體的粒徑、多分散系數、Zeta電位、包封率、釋放曲線，構建乳腺癌細胞U14的荷瘤裸鼠模型，研究吡柔比星脂質體對實體瘤的腫瘤抑制率。

1　材料與方法

1.1材料及儀器吡柔比星(Sigma-Aldrich試劑公司)，大豆卵磷脂、膽固醇(上海艾韋特醫藥科技有限公司)，二氯甲烷、甲醇(天津市風船化學試劑科技有限公司)。

恒溫水浴鍋(杭州迅數科技有限公司)、旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器有限公司)、透射電鏡(JEOL JEM-1230)、超聲波清洗儀(日本島津)、紫外-可見吸收光譜儀(Agilent 8453)、馬爾文粒度分析儀(ZEN3600，Malvern Instruments Ltd，UK)。昆明小鼠50只，SPF級，均為雌性，體重(18±2)g。U14宮頸癌細胞株(北京聯合利華生物技術有限公司)。

1.2吡柔比星脂質體的制備將一定量的大豆卵磷脂、吡柔比星和膽固醇溶于6 ml的甲醇-氯仿溶液中(氯仿與甲醇的體積比為2∶1)。在40℃，抽真空下除去有機溶劑，通氮氣5 min以除去殘留的有機溶劑.將10 ml磷酸緩沖液(pH7.4)加入茄型瓶中水化15 min，超聲15 min，經0.45 μm和0.22 μm濾膜過濾制得吡柔比星脂質體。

1.3吡柔比星脂質體的形態通過透射電子顯微鏡觀察脂質體形貌。將一滴脂質體滴加到銅網上，2 min后使用濾紙將銅網表面液體小心吸走。待銅網風干后使用2%的鉬酸銨對其進行負染并在風干后在透射電鏡下觀察。

1.4吡柔比星脂質體粒徑測定、多分散系數和Zeta電位測定取脂質體少量，適量蒸餾水稀釋后，激光粒度分析儀測定吡柔比星脂質體的平均粒徑及粒度分布、多分散系數和Zeta電位。

1.5吡柔比星脂質體包封率的測定采用超濾離心法測定吡柔比星脂質體的包封率。取吡柔比星脂質體2 ml，4 000 r/min離心30 min，收集下清液，紫外分光光度計分析下清液中吡柔比星含量(M游離)。脂質體溶液中吡柔比星總質量M總計算包封率：EE=(M總-M游離)/M總×100%。

1.6吡柔比星脂質體釋放曲線的測定取2 ml吡柔比星脂質體置入透析袋中，放入50 ml一次性離心管中；加入釋放介質(PBS，pH7.4)30 ml，于37℃、110 r/min恒溫振蕩。分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、16、24和40 h取樣2 ml(同時補充等溫等量釋放介質)，用紫外分光光度計于495 nm測定波長處測定吡柔比星的含量。

1.7荷宮頸癌U14小鼠模型的建立昆明小鼠飼養環境為室溫18℃～25℃，空氣濕度40%～60%，晝夜節律。墊料、籠具、飲水等高壓蒸汽滅菌處理，小鼠飼料為SPF級專用高壓滅菌飼料，更換墊料和籠具等操作在超凈工作臺內進行。用生理鹽水稀釋U14宮頸癌細胞株到適宜的濃度(1×107個/ml)，在每只小鼠的左前肢腋下注射，0.2 ml/只。

1.8小鼠分組將小鼠隨機分為5組，每組10只：①空白對照組：正常飼養，不予尾部靜脈注射；②陰性對照組：給藥14 d，隔天通過尾部靜脈的方法給予0.25 ml生理鹽水給藥；③陽性對照組：給藥14 d，隔天通過尾部靜脈的方法給予0.25 ml環磷酰胺溶液給藥；④吡柔比星脂質體組：給藥14 d，隔天通過尾部靜脈的方法給予0.25 ml吡柔比星脂質體溶液給藥；⑤吡柔比星裸藥組：給藥14 d，隔天通過尾部靜脈的方法給予0.25 ml吡柔比星裸藥溶液給藥。

1.9抑瘤率測定第14天處死小鼠后，取腫瘤組織，稱取其質量，計算抑瘤率：抑瘤率=(1-給藥組瘤質量/陰性對照組平均瘤質量)×100%。

2　結　果

2.1吡柔比星脂質體的形貌吡柔比星脂質體呈現一定的球狀形貌，視野內脂質體分布均勻，粒徑均一且圓整，粒徑約為140 nm。見圖1。

圖1　吡柔比星脂質體(TEM)

2.2吡柔比星脂質體的粒徑吡柔比星脂質體的平均粒徑為(140.9±2.36)nm，與透射電鏡下觀察的粒徑一致，其多分散系數為0.203±0.01。吡柔比星脂質體的粒徑分布呈正態分布，多分散系數表明粒徑分布比較集中，且達到了納米藥物的要求。因為腫瘤細胞生長速度快，細胞間距大致在100～200 nm，而正常組織間距在50 nm左右。納米藥物最適宜的粒徑應該在100～200 nm，這樣藥物更容易進入腫瘤組織而不易進入正常的組織間，從而發揮作用。

2.3吡柔比星脂質體的Zeta電位吡柔比星脂質體的Zeta電位在(-14.2±2.64)mV，表明脂質體具有一定的穩定性，可以長時間保存而不發生聚沉現象。

2.4吡柔比星脂質體的包封率用紫外分光光度計測在495 nm波長處測定吡柔比星濃度分別為5、10、15、20、30和40 μg/ml溶液的吸光度，吡柔比星的標準曲線為y=0.015 8x+0.061 4，R2=0.998 8。通過包封率計算公式可以計算得包封率為(75.1±3.5)%。

2.5吡柔比星釋放曲線如圖2所示，吡柔比星裸藥快速釋放且在第4小時處完全釋放，而吡柔比星脂質體前期釋放速度較快且逐漸變緩，吡柔比星脂質體相比于吡柔比星裸藥具有一定的緩釋性。吡柔比星脂質體可以緩釋吡柔比星，從而延長其在體內的保留時間，提高其藥效。

圖2　吡柔比星裸藥與吡柔比星脂質體釋放曲線

2.6吡柔比星脂質體對U14荷瘤小鼠腫瘤抑制作用吡柔比星脂質體的抑瘤率可以達到(75.1±8.6)%，而吡柔比星裸藥的抑瘤率為(64.9±12.2)%，說明吡柔比星可以抑制腫瘤的生長，而吡柔比星脂質體對腫瘤具有更好的抑制作用。吡柔比星脂質體可以提高吡柔比星的水溶性，其磷脂層可以介導藥物通過細胞膜。此外，吡柔比星脂質體的增加滯留和滲透(EPR)效應可以使藥物的被動靶向到腫瘤組織。并且，吡柔比星脂質體可以緩釋藥物，從而提高藥物的生物利用度。

3　討　論

本文以薄膜水化法制備吡柔比星脂質體，薄膜水化法適用于脂溶性藥物脂質體的制備，制備出的吡柔比星脂質體呈紅色混懸體系。透射電鏡下觀察吡柔比星脂質體的形貌，吡柔比星脂質體圓整且粒徑均一，并且分散均勻，與粒徑的分散系數測定結果一致。吡柔比星脂質體電位為-10.8 mV，可以是脂質體保持穩定，不產生絮凝。吡柔比星脂質體可以緩釋吡柔比星，延長其在體內時間。吡柔比星脂質體的粒徑可以使其通過EPR效應進入腫瘤組織。體外實驗吡柔比星脂質體組抑瘤率高于吡柔比星裸藥組，證明了吡柔比星脂質體是很有潛力的抗腫瘤藥物。

1Luo LM，Huang Y，Zhao BX，etal.Anti-tumor and anti-an-angiogenic effect of metronomic cyclic NGR-raodified liposomes containing paclitaxe〔J〕.Erials，2013；34(4)：1102-14.

2Alhariri M，Azghani A，Omri A.Liposomal antibiotics for the treatment of infectious diseases〔J〕.Exp Opin Drug Del，2013；10(11)：1515-32.

3Sun HY，Cacciarelli TV，Singh N.Micafungin versus amphotericin B lipid complex for the prevention of invasive fungal infections in high-risk liver transplant recipients〔J〕.Transplantation，2013；96(6)：573-8.

4Yogita PP，Sameer J.Novel methods for liposome preparation〔J〕.Chem Phys Lipids，2014；177：8-18.

5王瑞蓮，劉成梅，劉偉.脂質體制備方法的研究進展〔J〕.農產品加工學刊，2007；109(7)：8-14.

6Fujiwara A，Hoshino T，Westley JW.Anthracycline antibiotics〔J〕.Crit Rev Biotechnol,1985；3(2)：133.

7呂俊，丁念，朱家薔，等.蕙環類藥物心臟毒性及其預防的研究進展〔J〕.中國醫院藥學雜志，2008；28(15)：1302-6.

8賈彥熹，賈英杰，趙成，等.吡柔比星聯合化療治療晚期腫瘤37例臨床觀察〔J〕.腫瘤研究與臨床，2005；17(1)：59-60.

〔2016-07-14修回〕

(編輯曲莉)

吉林大學橫向課題(2014220101000363)

王麗萍(1963-)，女，主任醫師，碩士生導師，主要從事腫瘤病理學研究。

王學菊(1978-)，女，主治醫師，主要從事生物化學與分子生物學研究。

R73

A

1005-9202(2016)17-4174-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.017

1秦皇島市第一醫院