丁苯酞預處理對腦缺血再灌注損傷大鼠基質金屬蛋白酶-9、基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1和血腦屏障的影響

紀海茹　孔令偉　孔　維　趙淑敏　孔祥玉　陳　萌　鄭小影

(承德醫學院，河北　承德　067000)

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丁苯酞預處理對腦缺血再灌注損傷大鼠基質金屬蛋白酶-9、基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1和血腦屏障的影響

紀海茹孔令偉孔維1趙淑敏1孔祥玉1陳萌1鄭小影1

(承德醫學院，河北承德067000)

目的探討丁苯酞(NBP)預處理對腦缺血再灌注損傷(CIRI)大鼠基質金屬蛋白酶(MMP)-9、基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1和血腦屏障的影響。方法90只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、NBP預處理組低劑量組(NBPⅠ組)、NBP預處理組中劑量組(NBPⅡ組)、NBP預處理組高劑量組(NBP Ⅲ組)，每組18只。采用線栓法制作大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，缺血2 h再灌注24 h后以干濕重法測定腦組織含水量，收集腦血管外伊文思藍(EB)含量來評估血腦屏障的破壞程度，qPCR法檢測MMP-9及TIMP-1 mRNA的表達水平。結果腦缺血再灌注后，腦組織含水量及EB含量明顯增加，MMP-9和TIMP-1表達均增強，與假手術組比較有顯著差異(P<0.01)。NBP預處理各組腦組織含水量及EB含量較模型組明顯下降，MMP-9表達顯著減少，TIMP-1表達明顯增加(P<0.01)，NBPⅡ、Ⅲ組無顯著差異(P>0.05)。結論NBP預處理對CIRI大鼠可通過調節MMP-9/TIMP-1的表達，降低血腦屏障通透性，減輕腦水腫，發揮預防性保護作用。

丁苯酞;預處理;腦缺血再灌注損傷;基質金屬蛋白酶-9;基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1

腦缺血再灌注損傷(CIRI)后產生大量自由基、炎癥因子等有害物質，使血腦屏障(BBB)通透性增加，水和血漿成分漏出到周圍腦組織，最終導致血管源性腦水腫，嚴重時甚至可發生腦疝。顱內壓增高又進一步加劇BBB的破壞和腦血管通透性增加，導致腦水腫，形成惡性循環〔1〕。因此，通過保護BBB來減輕腦水腫的程度被看作治療CIRI的關鍵環節。近年研究顯示〔2〕，基質金屬蛋白酶(MMP)-9可降解細胞外基質、改變血管通透性，導致BBB破壞和腦水腫的發生，其在CIRI后表達顯著增加。基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1是MMP-9的特異性抑制劑，二者平衡關系的失調參與了BBB的破壞。觀察CIRI后二者表達水平的變化對評價藥物治療價值有重要意義〔3〕。丁苯酞(NBP)軟膠囊是作用于缺血性腦卒中多個靶點、多個環節的創新藥物〔4〕，對缺血性腦卒中有肯定的治療作用，但其預防性保護作用的機制尚不明了，本研究探討NBP對CIRI預防性保護作用及機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠90只，SPF級，體重260～280 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司〔許可證號：SCXK(京)2012-0001〕。大鼠經適應性飼養1 w后，隨機分為假手術組、模型組、NBP預處理組低劑量組(NBPⅠ組)、NBP預處理組中劑量組(NBPⅡ組)、NBP預處理組高劑量組(NBP Ⅲ組)，每組18只。

1.2實驗藥品及試劑NBP軟膠囊由石藥集團恩必普藥業有限公司提供，批號：118120711；伊文思藍購自TCI公司，批號：W8IFA-AT；RNasio Plus購自寶生物工程有限公司，批號：AK3701；實時熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司，批號：AK8203、AK2102。

1.3實驗儀器實時熒光定量PCR儀Mx3000P，美國安捷倫 Stratagene公司;3K30型冷凍離心機，德國SIGMA公司;移液器;勻漿器;顯微手術器械;直徑0.23 mm的魚線;自制大鼠固定板。

1.4實驗方法

1.4.1動物模型制備及處理大鼠適應性喂養1 w后，灌胃給藥，NBPⅠ組、Ⅱ組、Ⅲ組分別給予NBP 20、40、80 mg·kg-1·d-1，假手術組和模型組給等容積的生理鹽水，共7 d。模型組及給藥組采用Longa等〔5〕改良線栓法制備大鼠(MCAO)模型，假手術組僅分離右側頸總、頸外、頸內動脈，不插入線栓。術后單籠飼養，電暖氣低檔保暖。缺血2 h后抽提栓線至頸外動脈殘端內進行再灌注，再灌注24 h后做相應處理。

1.4.2腦組織含水量測定采用干濕重法。每組取6只大鼠麻醉后迅速取腦，去除小腦和腦干，分離出右側大腦，用電子天平稱其濕重后，置于100℃烤箱中烤干至恒重，腦組織含水量計算公式：(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.3BBB通透性測定采用伊文思藍(EB)作為示蹤劑監測BBB損傷程度的方法。各組取6只大鼠，再灌注23 h后，經大鼠尾靜脈注入2%的EB(4 ml/kg)，大鼠球結膜、皮膚等部分變藍表示注入成功。循環1 h后，經心臟灌注預冷的生理鹽水至右心房流出清亮液體時，快速斷頭取腦，取缺血側腦組織稱濕重后放入5 ml甲酰胺溶液中浸泡，54℃恒溫培養箱中孵育24 h，1 000 r/min離心5 min，移液器吸取其上清液200 μl用酶標儀測定其630 nm處的OD值。甲酰胺溶液做空白比色。腦組織EB含量計算公式：腦組織EB含量(μg/g)=待測樣品EB含量(μg/ml)×甲酰胺容量(ml)/腦濕重(g)，待測樣品EB含量根據標準曲線求得。

1.4.4實時熒光定量PCR方法檢測MMP-9、TIMP-1 mRNA表達水平每組取6只大鼠，再灌注24 h后麻醉取腦，預冷的生理鹽水沖洗后取缺血側腦皮質置于無酶管中-80℃凍存。使用寶生物工程有限公司提供的RNAsio Plus提取總RNA，紫外分光光度計檢驗RNA純度，要求波長在260/280 nm處吸光度比值為1.8～2.2。根據GenBank上登陸的MMP-9、TIMP-1的基因序列，以β-actin為內參照，設計合成引物。β-actin正義鏈：5′-CGCTGACAAGAAGTGGGGTTT-3′,反義鏈：5′-TACAGATGGTGGATGCCTTTTATG-3′；MMP-9正義鏈：5′-CCTGGTTCCCTGGCATAATC-3′；反義鏈：5′-CGCTCTGGTAGCCCTTCTC-3′；TIMP-1正義鏈：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′；反義鏈：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。根據Takara公司提供的實時熒光定量試劑盒采用SYBR法對MMP-9、TIMP-1 mRNA的表達水平進行測定，總反應體系為25 μl，包括Premix Ex TaqⅡ 12.5 μl,cDNA 2 μl，滅菌蒸餾水8.5 μl，上下游引物各1 μl(10 μmol/L)，放入實時定量PCR反應儀，反應條件：預變性95℃ 30 s，變性95℃ 5 s，退火51℃(MMP-9)、48℃(TIMP-1) 30 s，延伸72℃ 30 s，反應循環數為40，設置熔解曲線判斷是否有非特異性的擴增和引物二聚體的出現。分析方法利用2-ΔΔCt的方法。

1.5統計學處理采用SPSS17.0軟件進行One-way ANOVA檢驗。

2　結　果

2.1NBP預處理對腦組織含水量的影響 與假手術組比較，模型組與NBP預處理各組大鼠腦組織含水量顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，NBP預處理各組大鼠腦組織含水量均顯著減少(P<0.01)，NBPⅡ、Ⅲ組較NBPⅠ組減少更明顯(P<0.05)，但NBPⅡ、Ⅲ組之間差異并不明顯(P>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠大腦缺血側腦含水量、EB含量及MMP-9、TIMP-1 mRNA相對表達量的比較

與假手術組比較：1)P<0.01，與模型組比較：2)P<0.01；與NBPⅠ組比較：3)P<0.05

2.2NBP預處理對腦組織BBB通透性的影響 與假手術組比較，模型組與NBP預處理各組大鼠腦組織BBB通透性均顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，NBP各組大鼠腦組織BBB通透性均顯著降低(P<0.01),NBPⅡ、Ⅲ組較NBPⅠ組降低更多(P<0.05)，但NBPⅡ、Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05)。見表1。

2.3NBP預處理對腦組織MMP-9和TIMP-1 mRNA表達的影響假手術組大鼠腦組織內有MMP-9和TIMP-1均有微量表達；模型組大鼠腦組織內MMP-9的表達與假手術組比較明顯升高，TIMP-1也相應升高(P<0.01)；NBP預處理各組MMP-9表達均減少(P<0.01)，TIMP-1表達均增加(P<0.01)，其中NBPⅡ組較NBPⅠ組減少明顯(P<0.05)，NBP Ⅲ組與NBPⅡ組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

3　討　論

近年研究顯示，BBB的完整性在CIRI時發揮著舉足輕重的作用〔6〕，MMP-9是BBB損傷的關鍵點〔7〕，其在正常組織內僅有低水平的表達，在缺血缺氧等情況下表達量大幅增加〔8，9〕，可由星形細胞、 血管內皮細胞、 小膠質細胞、神經細胞、中性粒細胞和巨噬細胞等合成并分泌〔10〕，其在細胞外被激活后可水解細胞外基質，破壞BBB，致其通透性增加，引起血管源性腦水腫〔11〕。Asahi等〔12〕發現，敲除MMP-9基因的小鼠腦梗死體積明顯縮小，BBB破壞程度也顯著減輕。TIMP-1是MMP-9的內源性組織抑制因子,可與MMP-9特異性結合進而抑制其活性，阻斷MMP-9對細胞外基質和基底膜的降解〔13〕，二者的表達變化與腦含水量變化一致，參與了血腦屏障及血管基底膜的破壞〔14〕。本實驗結果顯示，缺血2 h再灌注24 h后，EB含量顯著增加，MMP-9表達明顯增多，與文獻報道一致〔15〕。

NBP可作用于腦缺血病理的多個環節，改善缺血后的多種病理變化，具有保護線粒體功能、抑制脂質過氧化、清除自由基、抑制炎癥反應、恢復能量代謝、抑制血小板集聚及增加缺血區血流量等藥理作用〔16〕。邵小鵬等〔17〕應用NBP治療老年血管性癡呆取得較好療效。

NBP預處理可能通過下調MMP-9、上調TIMP-1的表達，減輕BBB的損傷，降低腦水腫程度，進而發揮對CIRI的預防性的保護作用。提示NBP可預防性應用于缺血性腦卒中的高危人群，減輕腦損傷，為臨床防治缺血性腦損傷提供了新的思路。

1Jin G,Arai K,Murata Y,etal.Protecting against cerebrovascular injury:contributions of 12/15-lipoxygenase to edema formation after transient focal ischemia〔J〕.Stroke,2008;39(9):2538-43.

2劉昱言,劉軻,劉敬霞,等.基質金屬蛋白酶-2、-9與腦缺血微血管損傷的關系〔J〕.中國老年學雜志,2014;34(1):257-9.

3田培超,王懷立.MMP-9及TIIMP-1在大鼠感染性腦水腫的表達和意義〔J〕.中國實用神經疾病雜志,2007;10(3):9-11.

4紀海茹,孔維,趙淑敏,等.丁苯酞對腦缺血再灌注損傷保護作用的研究進展〔J〕.承德醫學院學報,2014;31(3):239-41.

5Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

6陳萌,孔維,趙淑敏,等.黃芩莖葉總黃酮預處理對局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬神經元和血腦屏障形態學的影響〔J〕.解剖學雜志,2012;35(3):341-4.

7曲思鳳,王佳妮,魏欣冰,等.氯沙坦對腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障通透性和MMP-9表達的影響〔J〕.山東大學學報,2007;45(10):992-5.

8Wu Y,Wang YP,Guo PP,etal.A Lipoxin A4 analog ameliorates blood-brain barrier dysfunction and reduces MMP-9 expression in a rat model of focal cerebral ischemia-reperfusion injury〔J〕.J Mol Neurosci,2012;46(3): 483-91.

9Xiang J,Lan R,Tang YP,etal.Apocynum venetum leaf extract attenuates disruption of the blood-brain barrier and upregulation of matrix metalloproteinase-9/-2 in a rat model of cerebral ischemia-reperfusion injury〔J〕.Neurochem Res,2012;37(8):1820-8.

10Jimei L,Yin L,Molly O,etal.DL-3-n-butylphthalide prevents neuronal cell death after focal cerebral ischemia in mice via the JNK pathway〔J〕.Brain Res,2010;1359:216-26.

11Gong Y,Hart E,Shchurin A,etal.Inflammatory macrophage migration requires MMP- 9 activation by plasminogen in mice〔J〕.J Clin Invest,2008;118(9):3012-24.

12Asahi M,Wang X,Mori T,etal.Effects of matrix metalloproteinase 9 gene knock out on the proteolysis of blood brain barrier and white matter components after cerebral ischemia〔J〕.J Neurol Sci,2001;21(19):7724-32.

13Krizanac-Bengez L,Hossain M,Fazio V,etal.Loss of flow induces leukocyte-mediated MMP/TIMP imbalance in dynamic in vitro blood brain barrier model role of pro-inflammatory cytokines〔J〕Am J Physiol Cell Physiol,2006;291(4):C740-9.

14陳合成,楊金升,楊軍,等.白藜蘆醇對大鼠腦缺血基質金屬蛋白酶-9及其組織抑制因子-1表達的影響〔J〕.中華老年心腦血管病雜志,2007;9(10):703-6.

15高蘭，婁季宇，楊霄鵬.丁苯酞對腦缺血再灌注損傷大鼠MMP-9活性和血腦屏障通透性的影響〔J〕.中風與神經疾病雜志,2012;29(2):116-8.

16李延可,劉寧,陳江君.丁苯酞對急性缺血性腦卒中的作用及機制研究〔J〕.中國醫藥導刊,2012;14(2):254-5.

17邵小鵬,桂樹華,胡玲玲.丁苯酞治療老年血管性癡呆的臨床療效及對精神心理量表的影響〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(22):5601-2.

〔2014-12-10修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

承德醫學院2016年校級課題項目(No.201627)

趙淑敏(1954-)，女，碩士，教授，碩士生導師，主要從事超微病理學，心、腦血管缺血性損傷機制與修復研究。

紀海茹(1987-)，女，住院醫師，在讀碩士，主要從事藥物治療缺血性腦血管疾病研究。

R965

A

1005-9202(2016)17-4171-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.016

1承德醫學院基礎醫學部