雙歧桿菌對高脂飲食誘導非酒精性脂肪性肝病大鼠血脂代謝的影響

胡迎賓　彭　娜　郭秋霞

(華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院消化內科，湖北　武漢　430030)

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雙歧桿菌對高脂飲食誘導非酒精性脂肪性肝病大鼠血脂代謝的影響

胡迎賓彭娜郭秋霞

(華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院消化內科，湖北武漢430030)

目的探討雙歧桿菌對高脂飲食誘導非酒精性脂肪性肝病大鼠血脂代謝的影響。 方法將45只雄性SD大鼠隨機等分為對照組、模型組和治療組。對照組喂以普通飼料，模型組喂以高脂飼料，治療組喂以高脂飼料和雙歧桿菌。6 w后比較各組大鼠肝指數和肝組織學改變，檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的水平以及肝總脂肪(HLs)含量，采用熒光實時定量RT-PCR測定禁食誘導脂肪因子(FIAF)mRNA的表達。 結果模型組肝指數和肝組織脂肪變性程度均顯著高于對照組(P<0.05)；而治療組肝指數和肝組織脂肪變性程度均顯著低于模型組(P<0.05)。與對照組比較，模型組ALT、AST、TC、TG和HLs水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組ALT、AST、TC、TG和HLs水平顯著降低(P<0.05)。與對照組比較，模型組FIAF mRNA的表達顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組FIAF mRNA的表達顯著降低(P<0.05)。 結論雙歧桿菌能夠降低NAFLD大鼠的血脂水平，減少肝臟組織中脂肪的沉積，改善肝臟的炎癥反應，其機制可能與調節脂質的攝入和抑制FIAF基因的表達有關。

雙歧桿菌；非酒精性脂肪性肝病；血脂代謝；禁食誘導脂肪因子

腸道內的微生物群落決定從食物中獲得能量的效率、并參與飲食結構變化所導致的代謝活動改變，尤其是在對于如高脂飲食這樣的環境壓力因素所做出的回應〔1〕。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是與代謝綜合征密切相關的肝臟表現，以異常脂肪積累為核心的代謝性疾病。研究表明，腸道微生物群與血脂之間有著千絲萬縷的聯系，可能具有調節血脂的作用〔2,3〕。作為腸道內最重要的優勢菌群之一，雙歧桿菌是否能夠通過調節血脂水平，從而影響NAFLD的發生發展尚不清楚。在本研究中我們通過高脂飲食喂養造成大鼠NAFLD模型，應用雙歧桿菌進行干預治療，觀察其對肝功能和血脂代謝的影響，為NAFLD的防治提供新的思路。

1　材料與方法

1.1實驗動物清潔級雄性SD大鼠45只，體重160～180 g，購于華中科技大學同濟醫學院實驗動物學部。在溫度20℃～22℃，濕度50%～60%，明暗周期12 h環境中飼養1 w后開始實驗。

1.2實驗試劑口服雙歧桿菌活菌散劑由麗珠集團麗珠制藥廠生產(批準文號：國藥準字S20040081，規格：每袋1.0 g)。Trizol購自美國Invitrogen公司，定量RT-PCR 試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.3動物分組、造模及處理將SD大鼠隨機等分為對照組、模型組和治療組。對照組喂以普通飼料和蒸餾水灌胃，模型組喂以高脂飼料(82%的普通飼料+8.3%的蛋黃粉+9%豬油+0.5%膽固醇+0.2%膽酸鈉)和蒸餾水灌胃，治療組喂以高脂飼料和溶于蒸餾水的雙歧桿菌活菌散劑(1.25 g·kg-1·d-1)灌胃。所有大鼠于6 w后處死，留取血清，肝組織和小腸組織標本備用。

1.4肝指數測定取大鼠肝臟，用等滲鹽水洗去血漬，濾紙吸干并稱重，計算肝指數。肝指數=(肝濕重/體質量)×100%。肝臟總脂肪(HLs)含量參照文獻〔4〕的測定方法。

1.5肝組織病理學檢查按常規方法進行蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察肝臟組織學改變情況。肝組織脂肪變性程度按脂肪變肝細胞占全部肝細胞的范圍分級：F0級：無脂肪變；F1級：30%以下肝細胞脂肪變；F2級，30%～60%肝細胞脂肪變；F3級，60%以上肝細胞脂肪變〔5〕。所有切片均由有經驗的病理科醫師盲法閱片。

1.6血清生物化學指標測定采用全自動生物化學分析儀測定血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量。

1.7熒光實時定量RT-PCR測定禁食誘導脂肪因子(FIAF)基因的表達①RNA提取：取100 mg小腸組織采用Trizol試劑盒提取組織總RNA，通過Tecan infinite M200 PRO多功能酶標儀測定RNA純度和濃度，以質量分數為1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。②反轉錄：依據說明書取總RNA 1 μg，5倍反轉錄緩沖液2 μl，dNTP 0.5 μl，反轉錄隨機引物0.5 μl，反轉錄酶0.25 μl，RNA酶抑制劑0.25 μl，無RNA酶去離子水補至10 μl。42℃ 15 min，95℃ 2 min，-20℃保存待用。③熒光定量PCR：PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。FIAF上游引物：5′-CTCTGGGATCTCCACCATTT-3′，下游引物：5′-TTGGGGATCTCCGAAGCCAT-3′； 18 S rRNA上游引物：5′-TACCGCAGCTAGGAATAATGG-3′，下游引物：5′-CGGAACTACGACGGTAT-3′。按說明書以反轉錄合成的cDNA為模板，然后用SYBR Green作為熒光標記物,在LightCycler熒光實時定量PCR儀(Roche公司,德國)上進行PCR反應。反應體系25 μl，反應條件95℃ 10 min 預變性，然后95℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 10 s，40個循環。通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，結果通過LightCycler軟件分析，以18 S rRNA 表達作為內參照，FIAF表達與18 S rRNA表達的比值作為FIAF基因的相對表達量。

1.8統計學方法應用SPSS10.0統計軟件進行方差分析、Student-Newman-Keuls檢驗及χ2檢驗。

2　結　果

2.1各組大鼠一般情況對照組，模型組和治療組大鼠的初始體重分別為：(171.14±6.53)g，(169.37±5.86)g和(168.71±5.91)g，差異無統計學意義(P>0.05)。至第6周末，模型組大鼠體重和肝指數均較對照組顯著升高(P<0.05)；治療組大鼠體質量和肝指數均較模型組顯著降低(P<0.05)，見表1。實驗過程中各組大鼠均無死亡。

表1　第6周末各組大鼠體重和肝指數比較±s，n=15)

與對照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05，下表同

2.2各組大鼠血清生化指標和HLs含量比較與對照組比較，模型組血清ALT、AST、TC、TG和HLs含量均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組血清ALT、AST、TC、TG和HLs含量均明顯降低(P<0.05)，見表2。

表2　各組大鼠血清生化指標和HLs含量的比較

2.3各組大鼠肝組織病理學變化HE染色見對照組大鼠肝小葉結構完整，肝索排列整齊，肝細胞大小均勻，無變性壞死；模型組大鼠肝細胞廣泛脂肪變性；治療組大鼠肝細胞脂肪變性較模型組明顯減輕，見圖1。與模型組比較，治療組脂肪變性分級有顯著改善(χ2=28.56，P<0.05)。

圖1　各組大鼠肝組織HE染色結果(×100)

2.4各組大鼠FIAF mRNA的表達與對照組(0.85±0.14)比較，模型組FIAF mRNA的表達明顯升高(1.27±0.21,P<0.05)；與模型組比較，治療組FIAF mRNA的表達明顯降低(1.11±0.19,P<0.05)。

3　討　論

益生菌是腸道內有益的活性微生物，它們通過改善宿主微生態平衡，影響宿主能量和物質代謝〔6〕，這為研究NAFLD等代謝性疾病提供了新的視角。

在本研究中，我們通過高脂飲食增加大鼠脂質攝入，經腸道吸收后入門靜脈，6 w后發現模型組中TC和TG水平顯著增加。而高水平的脂質一方面可以在肝中沉積，即模型組中HLs含量增加；另外一方面產生脂毒性，提升氧化應激水平，導致肝細胞膜損害，即模型組中ALT和AST水平升高。但是，通過雙歧桿菌干預后，我們發現無論是血脂水平和HLs含量，還是ALT和AST水平都顯著減低。雙歧桿菌對血脂代謝的影響有以下兩種途徑：一是雙歧桿菌產生結合膽汁酸水解酶，將結合膽汁酸轉變成游離膽汁酸,從而影響膽汁酸的腸肝循環,促使肝臟利用TC合成膽汁酸增加,實現了降低血TC的作用〔7〕；二是雙歧桿菌能將未消化吸收的碳水化合物酵解成短鏈脂肪酸，抑制肝臟脂肪合成酶的活性,從而使血TG水平降低〔8〕。此外，雙歧桿菌能夠保護腸道黏膜屏障，減輕內毒素血癥，避免肝細胞發生炎癥損傷〔9〕。

FIAF又被稱為血管生成素樣蛋白4，它以寡聚體、糖基化及各種亞型的形式存在，經細胞分泌后可直接進入血液循環，在脂肪代謝方面具有重要作用。Koliwad等〔10〕研究證實，FIAF通過使活化的脂蛋白脂肪酶(LPL)不可逆地轉化為非活化的LPL單體，抑制LPL的活性而減少血液循環血中TG的清除。在本研究中，我們發現雙歧桿菌能夠顯著降低FIAF基因的表達，同時血液中TG水平也隨之降低，可能與LPL活性增加有關。進一步研究證實，無菌小鼠由于提高了FAIF基因的表達水平，通過誘導過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子(PGC)-1α的表達，啟動了脂肪氧化的代謝途徑，增加了脂肪的消耗；而將高脂飲食飼養小鼠的微生物群植入無菌小鼠體內后,發現腸道內FAIF基因的表達受到抑制,血脂的水平明顯增加并貯存在肝臟和脂肪組織內〔11〕。由此可見，雙歧桿菌可能在減少脂肪的儲存過程中發揮了重要作用。

一方面，補充益生菌雙歧桿菌可以改善NAFLD大鼠的血脂代謝，另一方面，腸道微生物對膳食脂肪也會做出相應的反應。高脂飲食通過改變腸道微生物群的生存環境，使雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌等腸道正常菌群數量明顯減少，腸桿菌數量則相對增多,從而出現菌群失調或小腸細菌過度生長(SIBO)〔12〕。研究發現，SIBO可以改變腸細胞緊密連接，增加腸道黏膜通透性，從而增加脂質的攝入和參與炎癥反應的發生〔13〕。在本研究中，我們也證實高脂飲食誘導的模型組比普通飲食的對照組有更明顯的血脂代謝紊亂和炎癥損害。所以，高脂飲食可以引起腸道微生態失衡，進而腸道微生物群失調促進血脂代謝異常,提示腸道微生物群在NAFLD的發生發展中起著重要的作用。綜上，雙歧桿菌能夠降低NAFLD大鼠的血脂水平，減少肝臟組織中脂肪的沉積，改善肝臟的炎癥反應，其機制可能與調節脂質的攝入和抑制FIAF基因的表達有關。盡管益生菌通過維持腸道微生態的平衡，與NAFLD的發病機制有著密切的關聯性，但是益生菌抵御疾病形成而提供的保護作用仍然值得進一步深入探討。

1Delzenne NM,Neyrinck AM,B?ckhed F,etal.Targeting gut microbiota in obesity:effects of prebiotics and probiotics〔J〕.Nat Rev Endocrinol,2011；4(7):639-46.

2Million M,Lagier JC,Yahav D,etal.Gut bacterial microbiota and obesity〔J〕.Clin Microbiol Infect,2013；19(4):305-13.

3余仁強,袁金玲,馬路一,等.益生菌對肥胖大鼠血脂紊亂及胰島素抵抗的影響〔J〕.中國當代兒科雜志,2013；15(12):1123-7.

4Folch J,Lees M,Sloane-Stanley GH.A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues〔J〕.J Biol Chem,1957；226(1):497-509.

5Singh R,Wang Y,Xiang Y,etal.Differential effects of JNK1 and JNK2 inhibition on murine steatohepatitis and insulin resistance〔J〕.Hepatology,2009；49(1):87-96.

6Burcelin R,Garidou L,Pomié C.Immuno-microbiota cross and talk:the new paradigm of metabolic diseases〔J〕.Semin Immunol,2012；24(1):67-74.

7Mouzaki M,Comelli EM,Arendt BM,etal.Intestinal microbiota in patients with nonalcoholic fatty liver disease〔J〕.Hepatology,2013；58(1):120-7.

8Puertollano E,Kolida S,Yaqoob P.Biological significance of short-chain fatty acid metabolism by the intestinal microbiome〔J〕.Curr Opin Clin Nutr Metab Care,2014；17(2):139-44.

9Esposito E,Iacono A,Bianco G,etal.Probiotics reduce the inflammatory response induced by a high-fat diet in the liver of young rats〔J〕.J Nutr,2009；139(5):905-11.

10Koliwad SK,Kuo T,Shipp LE,etal.Angiopoietin-like 4 (ANGPTL4,fasting-induced adipose factor) is a direct glucocorticoid receptor target and participates in glucocorticoid-regulated triglyceride metabolism〔J〕.J Biol Chem,2009；284(38):25593-601.

11B?ckhed F,Manchester JK,Semenkovich CF,etal.Mechanisms underlying the resistance to diet-induced obesity in germ-free mice〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2007；104(3):979-84.

12Carter BA,Karpen SJ.Intestinal failure-associated liver disease:management and treatment strategies past,present and future〔J〕.Semin Liver Dis,2007；27(3):251-8.

13Duseja A,Chawla YK.Obesity and NAFLD:the role of bacteria and microbiota〔J〕.Clin Liver Dis,2014；18(1):59-71.

〔2015-05-19修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

武漢市衛生局臨床科研資助項目(WX12C33)

胡迎賓(1978-)，男，副主任醫師，醫學博士，主要從事慢性肝病及胃腸病的基礎與臨床研究。

R575.5；R589

A

1005-9202(2016)17-4169-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.015