雪蓮菌發(fā)酵乳對慢性肝損傷大鼠肝功能的影響

劉　馨　孔　淵　牛　惠　申道福

(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧　錦州　121001)

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雪蓮菌發(fā)酵乳對慢性肝損傷大鼠肝功能的影響

劉馨孔淵牛惠申道福

(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121001)

目的探討雪蓮菌發(fā)酵乳對四氯化碳(CCl4)導致的慢性肝損傷大鼠肝功能的影響。方法采用CCl4制備大鼠慢性肝損傷模型，設正常組、模型組、雪蓮菌發(fā)酵乳組和聯(lián)苯雙酯組(陽性對照)。測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)含量，同時觀察肝組織病理變化。結(jié)果模型組大鼠有明顯肝損傷表現(xiàn)，各給藥組肝損傷均有不同程度的改善(P<0.01 或P<0.05)。病理組織學檢查結(jié)果表明，給藥組肝臟病變程度均較模型組明顯減輕。結(jié)論雪蓮菌發(fā)酵乳可以緩解CCl4誘導的大鼠慢性肝損傷。

雪蓮菌；慢性肝損傷

雪蓮菌，又稱西藏靈菇、藏靈菇，外形酷似米粒，是一種乳白色、膠質(zhì)狀的塊狀物的野生菌，由微生物產(chǎn)生的胞外多糖與乳蛋白聚合而成〔1,2〕。雪蓮菌是一種天然形成的混菌發(fā)酵系統(tǒng)，是由多種微生物組成的微生態(tài)共生體系，其中包含乳酸菌和酵母菌及少量的醋酸菌〔3，4〕。Maeda等〔5〕發(fā)現(xiàn)雪蓮菌對自發(fā)性高血壓易卒中型大鼠具有降血脂降血壓的效應，Diniz等〔6〕研究認為雪蓮菌具有抗炎作用，Vinderola等〔7〕發(fā)現(xiàn)雪蓮菌具有調(diào)節(jié)免疫的功能，Silva等〔8〕發(fā)現(xiàn)雪蓮菌的殺菌作用，Gao等〔9〕又發(fā)現(xiàn)雪蓮菌發(fā)酵乳的cell-free fraction部分具有抑制胃癌細胞株SGC7901增殖的效應。本研究擬分析雪蓮菌發(fā)酵乳對四氯化碳(CCl4)導致慢性肝損傷大鼠的肝功能影響。

1　材料與方法

1.1材料雪蓮菌：西藏林芝生態(tài)綠色農(nóng)業(yè)合作社生產(chǎn)；聯(lián)苯雙酯滴丸： 北京協(xié)和藥廠；CCl4：天津市光復科技發(fā)展有限公司；魯花牌花生油：山東魯花集團有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(AIB)測定試劑盒均為長春匯力生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；健康 SD 雄性大鼠 40 只，體重(200±20)g，購自遼寧醫(yī)學院實驗動物中心，合格證號：LY20141122。

1.2造模所有動物自由進食和飲水，在適宜的溫度和濕度下飼養(yǎng)，光照周期 12 h/12 h；適應性飼養(yǎng)1 w。按照隨機分配原則，選取10只大鼠作為正常組，其余的 30 只大鼠進行慢性肝損傷造模。根據(jù)文獻記載〔10〕，給予需要造模的大鼠腹腔注射 50% CCl4/花生油溶液 0.15 mg/100 g ，每周注射兩次共注射8 w，建立大鼠慢性肝損傷模型。參照Rizk等〔11〕的方法制備雪蓮菌發(fā)酵乳，雪蓮菌粒培養(yǎng)于滅菌脫脂乳中，接種量5 g/100 ml，置于28℃條件下恒溫培養(yǎng)，每24 h更換一次滅菌脫脂乳，連續(xù)培養(yǎng)3 d。取第3天的發(fā)酵乳，濾去雪蓮菌粒，得到雪蓮菌發(fā)酵乳，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3分組給藥將造模成功后的30只大鼠隨機分為模型組、雪蓮菌發(fā)酵乳組和聯(lián)苯雙酯(陽性對照)組，每組10只。正常組和模型組大鼠給予同等劑量生理鹽水灌胃，雪蓮菌發(fā)酵乳組大鼠給予1 ml/100 g劑量的雪蓮菌發(fā)酵乳灌胃，聯(lián)苯雙酯組灌胃 0.1 g/kg聯(lián)苯雙酯，1次/d，連續(xù)8 w。8 w后應用 0.6%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，采集下腔靜脈血 3 ml，3 000 r/min離心10 min，留取血清，采用全自動生化分析儀測定 ALT、AST、ALP、TP、ALB水平。剪取大鼠肝左葉相同部位肝組織，置于 4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制備4 μm切片，HE 染色，在光學顯微鏡下觀察肝組織的損傷情況。

1.4統(tǒng)計學分析采用SPSS19.0軟件，兩組組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。

2　結(jié)　果

2.1動物的一般狀態(tài)正常組：大鼠毛有光澤，活動自如，飲食及大小便正常；模型組：隨著造模時間延長活動逐漸減少， 動物普遍出現(xiàn)食欲差，鼠毛稀疏， 皮毛粗糙無光澤，精神較萎靡，飲食量減少。在整個造模過程中體重增加緩慢，特別是在造模后期體重基本不增加甚至減輕；雪蓮菌發(fā)酵乳組：大鼠毛光澤，活動、飲食及大、小便均較模型組有所改善，給藥期間動物體重有所增加；聯(lián)苯雙酯組：大鼠一般情況改善效果較雪蓮菌發(fā)酵乳組更明顯。

2.2各組大鼠血清中 ALT、AST、ALP 活性情況與正常組相比，模型組大鼠血清ALT、AST、ALP均明顯升高，雪蓮菌發(fā)酵乳組及聯(lián)苯雙酯組大鼠血清ALT、AST、ALP水平有所降低，其中以聯(lián)苯雙酯組更明顯(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠血清ALT、AST、ALP活性比較

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.3各組大鼠血清中 TP、ALB水平變化變化與正常組相比，模型組大鼠血清TP和ALB水平均明顯升高，給藥后與模型組大鼠相比，雪蓮菌發(fā)酵乳組及聯(lián)苯雙酯組大鼠血清TP升高；聯(lián)苯雙酯組大鼠的ALB水平較模型組有所回升(P<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠血清 TP、ALB比較

圖1　各組大鼠肝臟病理改變(HE)

2.4雪蓮菌發(fā)酵乳對CCl4致慢性肝損傷大鼠肝臟病理損傷的影響圖1可見，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無細胞變性壞死，無炎性細胞浸潤也無膠原沉積模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，細胞變性嚴重，有明顯的脂肪變，炎性細胞浸潤及膠原增生嚴重。雪蓮菌發(fā)酵乳組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞減輕，肝內(nèi)亞假小葉結(jié)構(gòu)有所減少，細胞變性較少，炎性細胞浸潤較少，膠原增生較輕。聯(lián)苯雙酯組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯減輕，細胞變性現(xiàn)象較少見。

3　討　論

慢性肝損傷是機體在應對各種生物或者非生物損傷的過程中，致病因子刺激過程中所致肝實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞受損。若致病因子長時間存在，會導致肝細胞變性、壞死，甚至肝組織內(nèi)膠原沉積，導致肝纖維化，最終可以導致肝功能障礙，甚至肝衰竭〔10,12〕。CCl4進入大鼠肝臟，激活肝臟細胞色素 P450，繼而生成 CCl3，其可攻擊肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的磷脂分子，引起細胞膜的脂質(zhì)過氧化，導致膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的破壞〔13,14〕。隨著中毒次數(shù)與時間的增加和延長，慢性肝損傷及其早期肝纖維化就會越來越明顯。

CCl4所致大鼠慢性肝損傷的重要指標是血清 ALT、AST、ALP 酶活性明顯升高，ALB、TP含量明顯降低和肝臟病理學的變化。雪蓮菌包含由多種微生物組成的微生態(tài)群落，具有抗炎、殺菌、降血脂、降血壓、增強免疫力、防止癌細胞擴散等作用。Huseini等〔15〕發(fā)現(xiàn)雪蓮菌發(fā)酵乳(國外稱為開菲爾)是一種治療嚴重燒傷的有效藥物，其效果和傳統(tǒng)磺胺嘧啶銀鹽治療療效相當。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雪蓮菌發(fā)酵乳干預后，肝損傷模型大鼠血清中 ALT、AST、ALP活性均有所降低，ALB、TP 含量有所升高，肝組織病理明顯改善；雖沒有聯(lián)苯雙酯改善效果明顯，但已表明雪蓮菌發(fā)酵乳對CCl4所致動物慢性肝損傷具有一定的保肝降酶作用。

1周龍霞,鄭學云,薛鋒,等.天山雪蓮菌酸奶中菌株的分離及生理生化鑒定〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學,2013；41(18):7963.

2Zhou JZ,Liu XL,Huang KH,etal.Application of the mixture design to design the formulation of Pure cultures in Tibetan kefir〔J〕.Agric Sci Chin,2007;6(11):1383-9.

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6Diniz RO,Garla LK,Schneedorf JM,etal.Study of anti-inflammatory activity of Tibetan mushroom,a symbiotic culture of bacteria and fungi encapsulated into a polysaccharide matrix〔J〕.Pharmacol Res,2003;47(1):49-52.

7Vinderola CG,Duarte J,Thangavel D,etal.Immunomodulating capacity of kefir 〔J〕.J Dairy Res,2005;72(2):195-202.

8Silva KR,Rodrigues SA,Xavier L,etal.Antimicrobial activity of brothfermented with kefir grains 〔J〕.Appl Biochem Biotechnol,2009;152:316-25.

9Gao J,Gu F,Hui R,etal.Induction of apoptosis of gastric cancer cells SGC7901 in vitro by a cell-free fraction of Tibetan kefir 〔J〕.Int Dairy J,2013;30(1):14-8.

10張海燕,溫韜,盧靜,等.四氯化碳誘導大鼠慢性肝損傷模型方法的探討〔J〕.實用肝臟病雜志,2009；12(3):161-3.

11Rizk S,Maalouf K,Baydoun E.The antiproliferative effect of kefir cell-free fraction on HuT-102 malignant T lymphocytes 〔J〕.Clin Lymphoma Myeloma,2009;9(Suppl 3):S198-203.

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14程麗娟,陳曉農(nóng),劉青川,等.靈五顆粒對四氯化碳誘導大鼠慢性肝損傷的影響〔J〕.醫(yī)藥導報,2011；30(7):865-9.

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〔2015-11-27修回〕

(編輯郭菁/徐杰)

遼寧省科技廳科技計劃項目(2014410004)；遼寧醫(yī)學院校長基金項目

劉馨(1977-)，男，醫(yī)學博士，副教授，副主任檢驗師，碩士生導師，主要從事臨床腫瘤標記物研究。

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A

1005-9202(2016)17-4163-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.012