化濁通脈散對下肢動脈硬化閉塞癥家兔血小板衍化生長因子-a、-b表達的影響

吳　迪　李慎賢　胡　瑩　金鐘太　程　磊

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中醫(yī)科，遼寧　沈陽　110004)

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化濁通脈散對下肢動脈硬化閉塞癥家兔血小板衍化生長因子-a、-b表達的影響

吳迪李慎賢胡瑩金鐘太程磊

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中醫(yī)科，遼寧沈陽110004)

目的研究化濁通脈散對下肢動脈硬化閉塞癥(ASO)家兔的動脈硬化斑塊中血小板衍化生長因子(PDGF)-a、-b表達的影響。方法選純種新西蘭雄性白兔50只，隨機分為5組，每組10只：即正常組(A組)、模型組(B組)、化濁通脈散組(C組)、西洛他唑組(D組)、通塞脈片組(E組)，予高脂飲食及股動脈球囊擴張術(shù)建立ASO家兔模型，檢測藥物干預(yù)前后家兔血脂的變化，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)測定藥物干預(yù)后家兔股動脈標(biāo)本PDGF-a、PDGF-b的相對表達量。結(jié)果化濁通脈散能有效地降低血脂如總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，但升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)作用不明顯，可以顯著降低動脈硬化斑塊中細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1表達的陽性率(P<0.01)。結(jié)論化濁通脈散具有保護動脈血管內(nèi)膜，抑制動脈粥樣硬化形成的作用。

化濁通脈散；動脈粥樣硬化；血小板衍化生長因子

下肢動脈硬化閉塞癥(ASO)是目前常見病、多發(fā)病。隨著人群老齡化和飲食結(jié)構(gòu)不合理，ASO發(fā)病率逐年上升。西藥多從抗凝、溶栓、降脂等方面治療著手，且對防治慢性病程的ASO尚缺乏滿意療效。當(dāng)今對于本病治療的最新方法是干細(xì)胞移植，但其安全有效性仍需長期流調(diào)學(xué)觀察。本實驗?zāi)MASO形成過程，以化濁通脈散進行干預(yù)，檢測實驗前后家兔的血脂變化及動脈硬化斑塊組織中血小板衍化生長因子(PDGF)-a、-b的表達情況，闡明化濁通脈散治療ASO的作用靶點。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康純種的新西蘭雄性白兔50只，10月齡，體重2.8～3.0 kg，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(遼)2009-0002。

1.2實驗藥物化濁通脈散組成：黃芪、金銀花、膽星、半夏、茯苓、白術(shù)、澤瀉、焦山楂、川芎、延胡索、水蛭，由三九藥業(yè)集團提供，批號：0807021。通塞脈片，由江蘇南星藥業(yè)有限公司提供，批號：120509。西洛他唑片，由浙江大冢制藥有限公司提供，批號：120708T。膽固醇：由國藥集團化學(xué)試劑沈陽有限公司提供，批號：20120120。牛血清白蛋白注射液：由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號：20120106。

1.3實驗試劑與儀器①主要試劑：Triozol Reagent:美國Invitrogen Life technologies公司，引物合成：北京華大基因公司，熒光定量PCR試劑盒：大連寶生生物。血脂系列試劑由我院生化室提供。②主要儀器：德國Eppendorf5417R離心機，雅培ARCHITECTci8200全自動生化免疫分析儀，小型臺式離心機(美國SIGMA,1-13)，高速冷凍離心機Sigma 31k5C型，美國PCR擴增儀(德國Biometra)，紫外分光光度計(英國UV-visible Spectrometer,UV300)。

1.4實驗方法

1.4.1分組與造模造模前以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，排除飲食異常者。1 w后隨機分為5組，每組10只：即空白組(A組)、模型組(B組)、化濁通脈散組(C組)，西洛他唑組(D組)，通塞脈片組(E組)，分籠飼養(yǎng)。正常組喂養(yǎng)普通飼料，自由飲水。其余4組自實驗開始喂高脂飲食，每只每日在正常飼料中加膽固醇1 g、豬油5 g。第3天開始均在10%烏拉坦麻醉下由左側(cè)股動脈插管，4F氣囊導(dǎo)管拖拉右側(cè)髂股動脈8次，造成機械性內(nèi)膜損傷〔1〕。實驗第7天B、C、D、E組，按文獻經(jīng)耳緣靜脈一次性注射牛血清白蛋白250 mg/kg 造成免疫性內(nèi)皮損傷〔2〕；A組注射等量生理鹽水。

1.4.2藥物治療從21～24周末，各組改為正常飲食，進行藥物干預(yù)，C組予化濁通脈散按生藥7.2 g·kg-1·d-1，用量按70 kg成人用量3.3倍計算；E組予通塞脈片0.75片·kg-1·d-1，按60 kg體重成人每日用量20片計算；D組予西洛他唑片4.5 mg·kg-1·d-1，按60 kg體重成人的人兔體表換算公式計算，均混入飼料中喂養(yǎng)。

1.4.3各實驗指標(biāo)測定及方法血脂測定：各組動物于造模前及治療后分別取外周靜脈血5 ml，均以2 500 r/min離心30 min，以取得血清，2 h內(nèi)應(yīng)用雅培全自動生化免疫分析儀分別檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，比較各組數(shù)值造模前后的變化及各組之間的變化。

1.4.4實時熒光定量PCR檢測PDGF-a、PDGF-b mRNA含量實驗結(jié)束后將動物用乙醚麻醉，解剖切取股動脈血管多段，長約0.2～0.3 cm，放到盛有1 ml Trizol的1.5 ml EP管中保存，制備實驗標(biāo)本，然后處死動物。序列：GAPDH(105 bp)正義鏈：5' TGCCGCCTGGAGAAAG 3'；反義鏈：5' GACCTGGTCCTCGGTGTAG 3'；PDGF-a(252 bp)正義鏈：5' GCTGCGACCTTTGAGACA 3'，反義鏈：5' GCCCAGACTTGCGGACA 3'； PDGF(144 bp)正義鏈：5' TGCACCGCAACAAGCAC 3'，反義鏈：5' TGTAGCCGCCGTCACTCT 3'。操作步驟：參照Trizol說明書采取一步法提取總RNA。采用紫外可見光分光光度計測定260 nm、280 nmOD值，二者比值在1.8～2.0之間，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：37℃，15 min，85℃，5 s。應(yīng)用ABI 7500 擴增儀進行PCR擴增，反應(yīng)條件：95℃，0.5 min，1個循環(huán)，95℃，5 min，60℃，34 s，40個循環(huán)，95℃，15 s，60℃，1 min，95℃，15 s，1個循環(huán)。通過測定熒光強度而對PCR產(chǎn)物定量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件對數(shù)據(jù)的組間比較進行單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1血脂系列檢測結(jié)果造模前各組血脂指標(biāo)比較無顯著差異(P>0.05)。實驗結(jié)束后，B組、C組、D組、E組與A組相比，TC、TG、LDL-C均升高(P<0.01)；C組、D組、E組與B組相比較TC、TG、LDL-C均較低(P<0.01)，HDL-C較B組升高，但無顯著差異(P>0.05)；D組、E組與C組相比較TC、HDL-C無顯著差異(P>0.05)，但TG、LDL-C高于C組(P<0.05)。說明化濁通脈散對調(diào)控TC、TG、LDL-C有顯著效果，見表1。

表1　各組動物血脂指標(biāo)比較

與A組比較：1)P<0.01；與B組比較：2)P<0.01；與C組比較：3)P<0.05，下表同

2.2RT-PCR檢測結(jié)果與A組相比，B組、C組、D組、E組的PDGF-a、PDGF-b mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)，與B組相比，C組、D組、E組的PDGF-a、PDGF-b mRNA表達水平明顯下降(P<0.01)，與C組相比，D組、E組的PDGF-a、PDGF-b mRNA表達水平略有升高(P<0.05)。見表2。

表2　各組PDGF-a、PDGF-b mRNA表達比較

3　討　論

動脈硬化閉塞癥屬中醫(yī)“脈痹”、“脫疽〔1，3〕”、“血癖”范疇，在古典文獻中多有記載。如《外科理例》中記載了15例“脫疽”病例，就有“…年愈50亦患者，色紫黑，腳痛”。《外科正宗》也提到：“夫脫疽者，外腐而內(nèi)壞也。描述6例”脫疽中，就有“中年婦女，肥胖，生渴三載，右食指麻痹，月余后發(fā)黑”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病與飲食失節(jié)、臟腑虧虛、經(jīng)脈痹阻等有密切關(guān)系。飲食失節(jié)，膏粱厚味，損傷脾胃，濕濁內(nèi)生，痰癖互結(jié)，阻塞經(jīng)脈；或因年老體衰，氣血虧虛，運行無力，脈絡(luò)癖阻，氣虛血癖，經(jīng)脈痹阻，氣血不達四末而發(fā)為“脈痹”；或因肝腎虧虛，氣竭精傷，腎水消灼，筋練骨枯，而成“脫疽”之癥。總之在ASO形成的病機中，脾失健運，痰濕脂濁壅積，阻滯經(jīng)脈是其本，氣血淤滯不通，肢體失榮是其標(biāo)。本研究提出“痰、瘀、毒”互結(jié)病機新說。因飲食失節(jié)、臟腑虧虛、經(jīng)脈痹阻，致痰、濕、瘀久蘊成毒，脾虛是發(fā)病基礎(chǔ)，痰、瘀、毒為主要病理因素。我們遵循“治病務(wù)求其本”的原則，以“祛痰化瘀通絡(luò)、健脾解毒化濕”為治療大法，在補陽還五湯的基礎(chǔ)上加減化裁成化濁通脈散(黃芪、川芎、水蛭、金銀花、膽南星、半夏、茯苓、白術(shù)、澤瀉、焦山楂、延胡索)。此方從中醫(yī)角度加強了古方的活血化瘀、化濁通脈作用；從西醫(yī)方面加強了古方抗凝血、抗血栓形成、降脂及抑制血管內(nèi)壁動脈硬化板塊形成的作用。重用黃芪：補氣，使氣旺則血行，瘀消而不傷正，為君藥。川芎、水蛭：活血祛瘀，為臣藥。膽南星、半夏：祛痰泄?jié)嵬ńj(luò) 澤瀉：利水滲濕 焦山楂：消痰化瘀 金銀花：清熱解毒 延胡索：行氣止痛，行血中之氣，又能行氣中之血；共為佐藥。全方共同組成益氣化瘀通絡(luò)、健脾祛痰化濁之功。

高脂血癥作為動脈粥樣硬化(AS)的一種危險因素〔1〕，已被大家確認(rèn)，本實驗也證實了這點。TC、TG、LDL-C過高都是AS的危險因子，LDL-C是致動脈粥樣硬化的基本因素。LDL-C通過血管內(nèi)皮進入血管壁內(nèi),在內(nèi)皮下滯留的LDL-C被修飾成氧化型LDL(ox-LDL),ox-LDL-C不能被正常LDL-C受體識別，而被巨噬細(xì)胞的清道夫受體識別而快速攝取，巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL后形成泡沫細(xì)胞,后者不斷地增多、融合,構(gòu)成了動脈粥樣硬化斑塊的脂質(zhì)核心。ox-LDL可刺激機體產(chǎn)生大量的黏附分子、化學(xué)趨化分子、細(xì)胞因子、生長因子和細(xì)胞毒素等，進一步促進了動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展〔2〕。而HDL-C因為它能移除外周組織的膽固醇，轉(zhuǎn)運給肝臟進行分解代謝。HDL-C還可能通過抗炎、抗氧化和保護血管內(nèi)皮功能而發(fā)揮其抗動脈粥樣硬化作用。被認(rèn)為有防治動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的作用。本實驗研究證明化濁通脈散雖對HDL-C作用不明顯，但對TG、LDL-C有較明顯的抑制作用，亦減輕了以上LDL-C促動脈粥樣硬化的作用，說明化濁通脈散可通過減低血脂來抑制動脈粥樣硬化形成和發(fā)展。

在動脈硬化發(fā)生過程中，損傷的內(nèi)皮細(xì)胞分泌生長因子，PDGF與其受體結(jié)合能促進大量單核細(xì)胞聚集、黏附、增殖及向內(nèi)膜下遷移，形成單核細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞〔4〕。內(nèi)皮細(xì)胞分泌的PDGF，可以啟動動脈中膜平滑肌細(xì)胞(SMC)經(jīng)內(nèi)彈力膜的窗孔遷入內(nèi)膜，發(fā)生增生、轉(zhuǎn)化、分泌細(xì)胞因子以及合成細(xì)胞外基質(zhì)。SMC經(jīng)其表面的受體介導(dǎo)而吞噬脂質(zhì)，形成SMC源性泡沫細(xì)胞。可見PDGF在動脈硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。本實驗提示此方通過降低PDGF-a、PDGF-b抑制AS發(fā)生、發(fā)展。

1徐建,郝文君,白小涓,等.阿托伐他汀對兔動脈粥樣硬化的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2006;26(11):1550-1.

2隋萍,殷祿昌,劉曉紅.2型糖尿病患者合并下肢動脈硬化閉塞癥相關(guān)危險因素分析〔J〕.中國當(dāng)代醫(yī)藥,2010;19(3):7-9.

3張凡帆,龐鶴.動脈硬化閉塞癥中醫(yī)證候要素文獻分布研究〔J〕.北京中醫(yī)藥,2012;31(3)：172-4.

4李旭,邵明哲,范隆華.血小板衍化生長因子及其受體在糖尿病下肢動脈硬化閉塞癥中的表達及意義〔J〕.復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2011;38(40):303-9.

〔2015-04-11修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

遼寧省科技廳項目(201122520)

李慎賢(1952-)，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事周圍血管病研究。

吳迪(1985-)，女，醫(yī)師，碩士，主要從事周圍血管病研究。

R543.5

A

1005-9202(2016)17-4161-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.011