亞低溫對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及保護(hù)作用

黃　杰　李麗茹　張　斌

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院，上海　201400)

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亞低溫對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及保護(hù)作用

黃杰李麗茹張斌

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院，上海201400)

目的通過(guò)檢測(cè)絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)及Caspase-9蛋白的表達(dá)，探討亞低溫對(duì)局灶性腦缺血再灌注(IR)后神經(jīng)元存活的影響。方法用Longa線(xiàn)拴法制作局灶性腦IR模型，將40只SD大鼠隨機(jī)分成正常組、假手術(shù)組、常溫組和亞低溫組，常溫組和亞低溫組均缺血8 h,再灌注4 h、24 h、72 h、1 w(n=4)與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死，亞低溫組于腦缺血后12～15 min實(shí)施病灶側(cè)亞低溫持續(xù)4 h。免疫組化法檢測(cè)AKT及Caspase-9蛋白的表達(dá)。結(jié)果不同缺血再灌注時(shí)間點(diǎn)，亞低溫組比常溫組缺血側(cè)半暗帶AKT表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)，Caspase-9顯著降低(P<0.05)。結(jié)論亞低溫通過(guò)促進(jìn)缺血半暗帶腦組織AKT表達(dá)，抑制Caspase-9表達(dá)，從而抑制神經(jīng)元凋亡，減少神經(jīng)元損害。

腦缺血;亞低溫;凋亡;絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶;Caspase-9

研究表明絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3K)參與腦缺血再灌注(IR)后神經(jīng)元凋亡過(guò)程〔1〕，亞低溫對(duì)于腦缺血的保護(hù)作用是多方面的〔2〕，AKT、Caspase-9作為重要的細(xì)胞損傷相關(guān)因子越來(lái)越受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)建立大腦中動(dòng)脈梗死缺血模型觀(guān)察亞低溫對(duì)AKT、Caspase-9在腦缺血半暗帶區(qū)的影響及亞低溫的可能機(jī)制。

1　材料和方法

1.1動(dòng)物與分組選擇清潔級(jí)健康雄性SD大鼠40只，體重180～200 g，鼠齡6～8 w。由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(黑)20020002〕提供，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)(常溫自由進(jìn)食飲水)。大鼠隨機(jī)分為正常組(n=4)，假手術(shù)組(n=4)，常溫組(n=16)和亞低溫組(n=16)，其中常溫及亞低溫組分別在缺血8 h后再4 h,24 h,72 h和1 w，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4只。

1.2主要試劑和儀器一抗AKT、Caspase-9購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，二抗試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司，步驟同說(shuō)明書(shū)。亞低溫組采用可調(diào)控亞低溫儀(哈爾濱工業(yè)大學(xué)熱工教研室研制,專(zhuān)利號(hào)ZL98230936.0)。

1.3動(dòng)物模型制備手術(shù)參考改良的Nagasawa等〔3〕方法，制備大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈(MCA)缺血再灌注模型，在30 min 內(nèi)完成模型制作，亞低溫組于腦缺血后12～15 min誘導(dǎo)頭部亞低溫MCA 缺血8 h 后將尼龍線(xiàn)抽出頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)即可恢復(fù)MCA 血液供應(yīng)。MCA 閉塞后13～15 min內(nèi)把腦溫誘導(dǎo)至31℃～32℃并持續(xù)2～4 h，實(shí)驗(yàn)后脫離溫度調(diào)節(jié)，讓大鼠自然復(fù)蘇。MCA 閉塞后6 h 將大鼠處死，進(jìn)行組織處理和染色。假手術(shù)組不將尼龍線(xiàn)插入ICA，其余操作同常溫組及亞低溫組。

1.4組織標(biāo)本的制備各組大鼠分別于IR后各時(shí)間點(diǎn)經(jīng)心臟插管,生理鹽水沖洗,然后灌注4%甲醛內(nèi)固定取腦，于視交叉后3 mm 處取3 mm 厚組織，置于4%多聚甲醛液中固定24 h。常規(guī)脫水、石蠟包埋，冠狀面連續(xù)切片，厚度約3 μm，分別行HE 染色、免疫組化染色。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件行方差分析和t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1常溫組與亞低溫組AKT、Caspase-9 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較見(jiàn)表1，圖1。AKT 陽(yáng)性細(xì)胞主要位于缺血半暗帶區(qū)域。缺血24 h時(shí)達(dá)高峰，其后下降。亞低溫組比常溫組AKT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增高(P<0.05)。Caspase-9腦缺血再灌注4 h即有表達(dá)，主要位于缺血半暗帶，腦缺血再灌注24 h達(dá)高峰并持續(xù)到72 h，之后降低，亞低溫與常溫組相比，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。

表1　亞低溫對(duì)局IR后AKT、Caspase-9表達(dá)影響

常溫組AKT(×132)

亞低溫組AKT(×200)

常溫組Caspase-9(×132)

亞低溫組Caspase-9(×132)

2．2各組大鼠腦組織病理學(xué)改變假手術(shù)組與正常組大鼠腦組織均未見(jiàn)明顯異常。常溫組大鼠可見(jiàn)左側(cè)大腦皮質(zhì)有梗死灶，呈典型的缺血性改變，組織水腫明顯，神經(jīng)元變性、壞死。梗死灶與周?chē)X組織界限清楚，其中心區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。亞低溫組腦梗死灶較腦缺血組明顯減小，腦組織缺血性改變和腦水腫明顯減輕，見(jiàn)圖2。

圖2　常溫及亞低溫腦缺血病灶(HE，×200)

3　討　論

20世紀(jì)90年代，臨床應(yīng)用28℃～35℃亞低溫治療重型顱腦損傷和急性腦卒中取得了良好的效果，可能保護(hù)機(jī)制包括對(duì)于亞低溫治療腦梗死的作用機(jī)制考慮可能抑制一氧化氮(NO)、白三烯等的生成和釋放,減少腦細(xì)胞的代謝，降低酸中毒;抑制致炎細(xì)胞因子的生成和釋放;減少鈣離子內(nèi)流;促進(jìn)腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的修復(fù)，抑制壞死和線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C(CytC)誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡〔4,5〕。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)細(xì)胞凋亡研究出現(xiàn)的時(shí)間說(shuō)法不一可能與多種因素有關(guān)〔6〕。

PI3/AKT是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，活化的AKT通過(guò)磷酸化作用進(jìn)一步激活或抑制其下游靶蛋白，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化等作用。AKT，是PI3K直接的下游作用靶點(diǎn)，具有抗凋亡作用，其抗凋亡作用一方面可通過(guò)磷酸化并激活下游的凋亡調(diào)控蛋白，如Caspase-9、NF-κB等，調(diào)節(jié)抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)PI3K/Akt途徑的調(diào)控可以降低損傷及IR引起的腦損傷，AKT在腦缺血后對(duì)于缺血區(qū)神經(jīng)元具有保護(hù)作用，起保護(hù)作用是多方面的，可能通過(guò)眾多的信號(hào)通路來(lái)完成其抗凋亡作用〔7,8〕。本研究提示亞低溫可抑制腦缺血后細(xì)胞凋亡，減輕缺血性腦水腫、腦損害，明顯縮小腦梗死體積，具有腦保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AKT、Caspase-9表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞多位于缺血半暗帶區(qū)，參與缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，亞低溫治療可使AKT的表達(dá)上調(diào)，Caspase-9的表達(dá)下調(diào)，提示亞低溫治療可能抑制或延緩了細(xì)胞凋亡，說(shuō)明亞低溫對(duì)于腦缺血具有護(hù)作用。

綜上所述，本研究推測(cè)亞低溫可能通過(guò)AKT信號(hào)途徑抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)腦IR后的損傷起到保護(hù)作用。

1Wang HY，Wang GL，Yu YH，etal． The role of phosphoinositide-3-kinase/Akt pathway in propofol-induced postconditioning against focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.Brain Res，2009；1297:177-84．

2Roberto Alexandre Dezena,Benedicto Oscar Colli,Carlos Gilberto Carlotti Junior,etal.Pre,intra and post-ischemic hypothermic neuroprotection in temporary focal cerebral ischemia in rats:morphometric analysis〔J〕.Arq Neuropsiquiatr，2012;70(8):609-16.

3Nagasawa H，Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologic hanges in a new rat model of middle cerebral artery occlusion〔J〕.Stroke，1989;20(8):1037-43.

4宋祖軍，馬俊清，余厚友,等.亞低溫對(duì)大鼠急性脊髓損傷后炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)急救醫(yī)學(xué)雜志，2009;29(2)：137-9.

5Wang JK，Yu LN，Zhang FJ，etal.Post conditioning with sevoflurane protects against focal cerebral ischemia and reperfusion injury via PI3K/Akt pathway〔J〕.Brain Res，2010;1357:142-51．

6Choi R,Andres RH,Steinberg GK,etal.Intraoperative hypothermia during vascular neurosurgical procedures〔J〕.Neurosurg Focus,2009;26:E24.

7Luca Filippi,Patrizio Fiorini,Marta Daniotti,etal.Safety and efficacy of topiramate in neonates with hypoxic ischemic encephalopathy treated with hypothermia〔J〕.Neo Nati.BMC Pediat,2012;12:144.

8Yuan Y，Guo Q，Ye Z，etal． Ischemic postconditioning protects brain from ischemia /reperfusion injury by attenuating endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis through PI3K-Akt pathway〔J〕.Brain Res,2011;1367(1):85-93．

〔2014-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

上海市衛(wèi)生局面上項(xiàng)目(No.20124286)；上海市奉賢區(qū)科委(No.奉科2010-101101；奉科2013-101102)

李麗茹(1970-)，女，主任醫(yī)師，副教授，主要從事心腦血管疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

黃杰(1970-)，男，碩士，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。

R743.1

A

1005-9202(2016)17-4153-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.007