響應(yīng)面法優(yōu)化棉花黃萎病拮抗菌Bacillus axarquiensisTUBP1產(chǎn)抗菌蛋白發(fā)酵條件研究

馬江鋒　曾 紅

(1 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)(2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站， 新疆 烏魯木齊 830011)

?

響應(yīng)面法優(yōu)化棉花黃萎病拮抗菌Bacillus axarquiensisTUBP1產(chǎn)抗菌蛋白發(fā)酵條件研究

馬江鋒1,2曾 紅1*

(1 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)(2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站， 新疆 烏魯木齊 830011)

本實(shí)驗(yàn)擬采用Plackett Burman(PB)試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出影響B(tài)acillus axarquiensis TUBP1產(chǎn)抗菌蛋白關(guān)鍵因素，并采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)中Box-Behnken(BB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對其產(chǎn)抗菌蛋白最佳配比進(jìn)行優(yōu)化。本文使用Plackett Burman設(shè)計(jì)對影響B(tài). axarquiensis TUBP1產(chǎn)抗菌蛋白的8個(gè)因素進(jìn)行篩選，得到影響抗菌蛋白產(chǎn)量顯著的因素為葡萄糖、蛋白胨和發(fā)酵pH。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用Box-Behnken設(shè)計(jì)對這3個(gè)顯著因素的最佳配比進(jìn)行優(yōu)化，得到葡萄糖、蛋白胨、pH最佳配比為葡萄糖2. 53%、蛋白胨1.76%和pH7. 17，與優(yōu)化前相比蛋白產(chǎn)量提高了34. 55%。

B. axarquiensis TUBP1； 響應(yīng)面法； 抗菌蛋白； 發(fā)酵條件

棉花黃萎病影響棉花的產(chǎn)量和質(zhì)量，也直接影響產(chǎn)棉地區(qū)農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入，其是由半知菌亞門大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb)引起的維管束真菌性病害[1-2]。目前針對棉花黃萎病的防治常規(guī)方法有化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)措施以及培育抗病品種等手段，但是沒有明顯的防病效果。“以菌治菌”的生物防治因其無污染、無殘留、不易使植物病原菌產(chǎn)生耐藥性、生產(chǎn)工藝及流程簡單等特點(diǎn)，以及有些生防菌還能促進(jìn)農(nóng)作物生長，倍受許多研究學(xué)者青睞[3-4]。

生防菌種類有放線菌[5]、霉菌[6]、細(xì)菌[7-9]，不同生防菌作用機(jī)理也有所不同，其中產(chǎn)生次生代謝抗菌產(chǎn)物達(dá)到抗菌作用是生防機(jī)理之一，據(jù)報(bào)道有subtilin、plipastatin、subtilosin、fengycin、sunlancin、surfactin、iturin等抗菌物質(zhì)從芽孢桿菌中分離得到。本實(shí)驗(yàn)室從新疆南疆棉田土壤中分離得到的阿薩爾基亞種(Bacillus axarquiensis TUBP1)對新疆連作棉田棉花黃萎病有抑制作用，其田間生防效果可達(dá)43. 07%[10]，針對B. axarquiensis TUBP1分類學(xué)地位有零星報(bào)道[11]，而對此菌代謝產(chǎn)物及代謝產(chǎn)物發(fā)酵條件未見相關(guān)報(bào)道。前期試驗(yàn)表明其抗菌活性成分主要是以胞外蛋白為主，針對其抗菌蛋白發(fā)酵條件研究國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，基于前期研究基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)采用Plackett Burman、Box-Behnken優(yōu)化B. axarquiensis TUBP1產(chǎn)蛋白發(fā)酵條件，提高其次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，為進(jìn)一步開發(fā)其作為生防菌進(jìn)行小規(guī)模生產(chǎn)及發(fā)酵奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種

植物病原菌：大麗輪枝菌 (V. dahliae Kleb ACCC36211)

生防菌TUBP1分離于新疆農(nóng)一師12團(tuán)棉田土壤并通過生理生化和分子學(xué)手段鑒定為B. axarquiensis TUBP1[11]，且生防效果可達(dá) 43. 07%，以上病原菌及拮抗菌均由塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2供試培養(yǎng)基配方

NB培養(yǎng)基：5 g NaCl，10 g蛋白胨，20 g葡萄糖，5 g牛肉膏，1 000 mL蒸餾水

發(fā)酵培養(yǎng)基：NB基礎(chǔ)培養(yǎng)基(根據(jù)表2中配方進(jìn)行配制)

1.2方法

1.2.1拮抗菌B. axarquiensis TUBP1種子液的制備

將60 mL配置的NB培養(yǎng)基裝于250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min后，每瓶接種2 mL拮抗菌B. axarquiensis TUBP1，37 ℃、180 r/min，培養(yǎng)24 h后，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2拮抗菌B. axarquiensis TUBP1發(fā)酵液制備和抗菌蛋白含量測定

50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基接種2 mL B. axarquiensis TUBP1種子液，置于恒溫震蕩培養(yǎng)器，37 ℃、180 r/min條件下，培養(yǎng)48 h，5 000 g離心20 min，收集發(fā)酵上清液 4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

發(fā)酵上清加入80%飽和度的硫酸銨。置于4 ℃冰箱沉淀過夜，5 000 g離心20 min，棄上清液收集沉淀，用磷酸緩沖液PBS(pH 7. 2)進(jìn)行溶解，裝于截流分子量為8 000～14 000的透析袋中，置于4 ℃冰箱透析過夜。透析袋里蛋白質(zhì)溶液用微孔濾膜過濾(Φ=0. 22 μm)除去雜質(zhì)，并用考馬斯亮藍(lán)法測蛋白質(zhì)含量[12]。1.2.3Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及Box-Benhnken設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件

Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design Expert.8.0 軟件將B. axarquiensis TUBP1發(fā)酵培養(yǎng)的8個(gè)條件(蛋白胨、葡萄糖、初始pH、氯化鈉、轉(zhuǎn)速、接種量、溫度、裝液量)分別作為PB試驗(yàn)的因素，采用試驗(yàn)次數(shù)N=12的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素分別取2個(gè)水平，如表1所示。然后按照PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)并采用考馬斯亮藍(lán)法測胞外蛋白含量[12]，以期找出影響B(tài). axarquiensis TUBP1產(chǎn)胞外蛋白含量最顯著的因素。

Box-Benhnken(BB)試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件，根據(jù)PB試驗(yàn)確定的因素和水平，采用BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)對B. axarquiensis TUBP1產(chǎn)胞外蛋白條件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。得出影響B(tài). axarquiensis TUBP1胞外蛋白含量的最佳發(fā)酵條件。

1.2.4B. axarquiensis TUBP1產(chǎn)胞外蛋白發(fā)酵條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)響應(yīng)面法中BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到B. axarquiensis TUBP1產(chǎn)胞外粗蛋白發(fā)酵條件，重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)B. axarquiensis TUBP1產(chǎn)胞外蛋白發(fā)酵條件，與理論產(chǎn)胞外蛋白相比較，檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠行浴?/p>

表1　Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平及編碼

表2　Placketts Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2　結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基中氮源、碳源、無機(jī)鹽篩選結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)前期已成功篩選出了最佳氮源為蛋白胨、最佳碳源為葡萄糖、最佳無機(jī)鹽為氯化鈉。

2.2Plackett Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果

基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對影響B(tài). axarquiensis TUBP1產(chǎn)抗菌蛋白的8個(gè)因素(葡萄糖、pH、氯化鈉、裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速、溫度)一起進(jìn)行考察，每個(gè)因素考察2個(gè)水平，以蛋白含量為響應(yīng)值，試驗(yàn)因素如表1所示，PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，PB方差分析如表3所示，由表3可知，試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著(p<0. 01)，說明PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)適合優(yōu)化B. axarquiensis TUBP1產(chǎn)蛋白質(zhì)發(fā)酵條件。由PB方差分析表，得到影響B(tài). axarquiensis TUBP1產(chǎn)蛋白含量最為顯著的三個(gè)因素分別為：A(葡萄糖)、B(蛋白胨)和C(初始pH)。

表3　Plackett Burman方差分析

續(xù)表3

來源平方和均方F值P值顯著性EG2.402.402.030.3914EH1.131.134.730.4493FG0.830.830.910.0616FH0.620.621.020.9021GH0.080.083.530.5102A23.363.364.120.0007**B21.511.510.560.0041**C21.491.490.370.0016**D20.030.032.830.0544E20.380.383.840.0627F22.272.2711.780.3724G210.8810.886.790.1728H24.304.302.930.0822殘差27.3490.34失擬項(xiàng)18.934.921.390.5437

注：**. P<0. 0 1為差異極顯著；*. P<0. 0 5為差異顯著

2.3Box-Behnken響應(yīng)面分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4　響應(yīng)面三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表5　Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果

續(xù)表5

試驗(yàn)號A-葡萄糖%B-蛋白胨%C-pH蛋白質(zhì)含量μg/mL600020.4270-1-120.3180-1113.909-11017.301001115.701110-117.431201-120.101300020.50141-1015.301500020.601600020.501710113.62

基于PB 試驗(yàn)結(jié)果分析基礎(chǔ)上，對影響蛋白含量的主要3個(gè)因素，葡萄糖、蛋白胨和pH進(jìn)一步采用BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，試驗(yàn)三因素(葡萄糖、蛋白胨和pH)三水平及編碼見表4，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表5，PB方差分析如表6所示，由表6可知，試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著(p<0. 01)，由此可說明BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)適合對影響B(tài). axarquiensis TUBP1產(chǎn)蛋白質(zhì)最顯著的3個(gè)因素(葡萄糖、蛋白胨和pH)進(jìn)行最佳配比優(yōu)化。

2.3.1響應(yīng)面方差分析結(jié)果

表6　響應(yīng)面回歸模型方差分析

R2=0. 972 0;Adj R-Squared=0. 943 9; Adeq Precision=13. 274

注：**. P<0. 0 1為差異極顯著；*. P<0. 0 5為差異顯著

利用Minitab 16軟件對BB試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸方程擬合，獲得拮抗細(xì)菌B. axarquiensis TUBP1發(fā)酵抗菌蛋白對蛋白胨、葡萄糖和pH的多元二次回歸方程:Y=44. 112 7+0. 975 3A+0. 070 5B-2. 045 0C+0. 146 5AB-1. 60 71AC-0. 308 7BC-0. 218 4A2-0. 085 7B2-2. 461 3C2

式中：Y為抗菌蛋白含量，A為葡萄糖，B為蛋白胨，C為pH，根據(jù)回歸方程得出最佳的拮抗蛋白含量為20. 93 μg/mL。

由表6可知，P值的大小可以判斷各因素對拮抗菌B. axarquiensis TUBP1產(chǎn)蛋白影響的強(qiáng)弱。P值越小，對產(chǎn)蛋白影響作用越強(qiáng)。拮抗菌B. axarquiensis TUBP1發(fā)酵液產(chǎn)蛋白的影響程度大小的次序?yàn)閜H(C)>葡萄糖(A)>蛋白胨(B)。

2.3.2響應(yīng)面圖分析

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y對應(yīng)與實(shí)驗(yàn)因素X1、X2和X3(X1為葡萄糖，X2為蛋白胨，X3為pH)所構(gòu)成的三維空間的曲面圖及其在二維平面上的等高線圖，其可以直觀的反映各因素及它們之間的交互作用對響應(yīng)值的影響，結(jié)果見圖1至圖3。

圖1　蛋白胨和葡萄糖對B. axarquiensis TUBP1菌株產(chǎn)蛋白含量影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖2　葡萄糖和pH對B. axarquiensis TUBP1產(chǎn)蛋白含量影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖3　蛋白胨和發(fā)酵pH對B. axarquiensis TUBP1產(chǎn)蛋白含量影響的響應(yīng)面和等高線圖

由圖1可知，隨著葡萄糖和蛋白胨含量的逐漸增大，B. axarquiensis TUBP1產(chǎn)拮抗蛋白含量由高變低，由此可知，適當(dāng)?shù)脑龃笃咸烟呛偷鞍纂撕浚梢栽谝欢ǔ潭壬咸岣咴摼晁a(chǎn)蛋白質(zhì)的含量。由圖2可知，隨著pH的增大與葡萄糖濃度的提高，菌株產(chǎn)生蛋白質(zhì)也是表現(xiàn)為由高變低。在圖3中，pH的適當(dāng)增大及蛋白胨含量的增加對菌株產(chǎn)蛋白的影響與圖2的響應(yīng)面圖形相似，通過對該模型方程的求解及其模型驗(yàn)證試驗(yàn)得知，棉花黃萎病拮抗菌B. axarquiensis TUBP1最優(yōu)的發(fā)酵條件為葡萄糖2. 53%、蛋白胨1. 76%和pH7. 17。因此，在實(shí)際操作中，應(yīng)適當(dāng)控制蛋白胨、葡萄糖的含量及pH值，以獲得B. axarquiensis產(chǎn)較高的蛋白質(zhì)。

2.4B. axarquiensis TUBP1產(chǎn)抗菌蛋白最佳工藝條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

進(jìn)一步通過重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果準(zhǔn)確性，結(jié)果如表7所示，由表7可以看出，在最佳工藝條件下，B. axarquiensis TUBP1菌株產(chǎn)生的拮抗蛋白平均值實(shí)際上可達(dá)20. 91 μg/mL，實(shí)際值與預(yù)測值相接近，且重復(fù)性良好，由此可以說明B. axarquiensis TUBP1產(chǎn)抗菌蛋白條件優(yōu)化結(jié)果可靠可行。

表7　B. axarquiensis TUBP1產(chǎn)抗菌蛋白最佳工藝條件驗(yàn)證結(jié)果

3　討論

拮抗菌的次生代謝產(chǎn)物是其主要抗菌方式之一，影響抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的因素有碳源、氮源和無機(jī)鹽等，傳統(tǒng)方法是先進(jìn)行單次單因素試驗(yàn)，再采用正交試驗(yàn)確定單因素的最佳組合，此方法僅能在確定單因素基礎(chǔ)上，比較已選定的水平的好壞，而并非獲得最佳的優(yōu)化條件[13]。Plackett-Burman設(shè)計(jì)是從許多影響代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的變量間快速篩選出主要因素，再通過與響應(yīng)面方法結(jié)合確定這些主要因素最佳水平，此方法可以彌補(bǔ)以前在微生物培養(yǎng)條件優(yōu)化中的一些不足。許多學(xué)者通過用此方法提高了微生物次生代謝產(chǎn)物[14-15]。

本課題組對已分離棉花黃萎病菌拮抗菌株B. axarquiensis TUBP1抗菌活性成分分析，初步確定為胞外蛋白，有望開發(fā)成新型農(nóng)用抗棉花黃萎病菌藥物。為提高B. axarquiensis TUBP1發(fā)酵產(chǎn)抗菌蛋白的能力，本研究首先通過用PB設(shè)計(jì)對影響B(tài). axarquiensis TUBP1產(chǎn)蛋白的8個(gè)因素(葡萄糖、pH、氯化鈉、裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速、溫度)進(jìn)行考察，并利用Minitab 16軟件篩選出了關(guān)鍵因素為葡萄糖、蛋白胨和pH，并通過響應(yīng)面法中BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)對發(fā)酵條件中的葡萄糖、蛋白胨和pH進(jìn)行優(yōu)化，獲得B. axarquiensis TUBP1產(chǎn)蛋白最優(yōu)條件，進(jìn)一步驗(yàn)證最優(yōu)條件，實(shí)驗(yàn)重復(fù)值與預(yù)測值擬合良好。

4　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出棉花黃萎病拮抗菌B. axarquiensis TUBP1抗菌蛋白發(fā)酵條件中的關(guān)鍵因素為葡萄糖、蛋白胨和發(fā)酵pH。并通過全因子中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法，明確其最佳配比為葡萄糖2. 53%、蛋白胨1. 76%和pH7. 17。在此條件下，得到抗菌蛋白含量最高為20. 91 μg/mL，與優(yōu)化前相比蛋白產(chǎn)量提高了34. 55%。

[1]李輝.中國新疆棉花產(chǎn)業(yè)國際競爭力研究[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[2]Liu S S, Rao A, Bradleigh Vinson S. Biological Control in China: Past, present and future - An introduction to this special issue[J]. Biological Control, 2014, 68: 1-5.

[3]劉姮,李銀姣,鄧漢斌.棉花黃萎病的綜合防治[J].湖北植保,2011,06:25-29.

[4]Yu S M, Lee Y H. Effect of light quality on Bacillus amyloliquefaciens JBC36 and its biocontrol efficacy[J]. Biological Control, 2013, 64: 203-210.

[5]Xue Q H, Chen Q, et al. Isolation and evaluation of rhizosphere actinomycetes with potential application for biocontrol of Verticillium wilt of cotton [J]. Crop Protection, 2013, 43: 231-240.

[6]宋曉妍,陳秀蘭,孫彩云, 等.棉花黃萎病菌拮抗木霉的篩選及其抑菌機(jī)制的研究 [J].山東大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 40(6) :98-102．

[7]Erdoga O, Benlioglu Kemal. Biological control of Verticillium wilt on cotton by the use of fluorescent Pseudomonas spp. under field conditions[J]. Biological Control, 2010, 53(1): 39-45.

[8]Li L, Ma J, Li Y, et al. Screening and partial characterization of Bacillus with potential applications in biocontrol of cucumber Fusarium wilt[J]. Crop Protection, 2012, 35: 29-35.

[9]Haasd, Défago G. Biological control of soil-borne pathogens by fluorescent pseudomonads [J].Nature Review Microbiology, 2005, 3(4):307-319.

[10]曾紅,楊生強(qiáng).棉花黃萎病菌拮抗細(xì)菌 TUBP1 的分離鑒定及其防病作用 [J].棉花學(xué)報(bào), 2014, 26(5):445-451.

[11]Wang L T, Lee F L, Tai C J, et al. Reclassification of Bacillus axarquiensis Ruiz-Garcia et al. 2005 and Bacillus malacitensis Ruiz-Garcia et al. 2005 as later heterotypic synonyms of Bacillus mojavensis Roberts et al[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57(7): 1663-1667.

[12]Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A L, et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent[J]. J Biol Chem, 1951, 193: 265-275.

[13]Li F, Li RP, Jin L, et al. Study on a protein kinaseslysis activity of Bacillus subtilis HW-2: Selection of liquid fermentation conditions[J]. Progress in Biotechnology, 1997, 17(3): 31-33.

[14]鄭媛,王躍軍,孫謐. 海洋側(cè)孢短芽孢桿菌 Brevibacillus laterosporus Lh-1產(chǎn)抗菌肽 R-1 的培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].微生物學(xué)通報(bào), 2009, 36(3):398-403.

[15]劉代新,寧喜斌,張繼倫.響應(yīng)面分析法優(yōu)化副溶血性弧菌生長條件[J].微生物學(xué)通報(bào), 2008, 35(2): 306-310.

Optimizing Fermentation Conditions of Antagonistic Bacillus axarquiensis TUBP1Against Verticillium dahlia by Response Surface Method

Ma Jiangfeng1,2Zeng Hong1*

(1 Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin, Xinjiang Production and Construction Group/College of Life Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)(2 Institute for the Control of Agrochenicals, Xinjiang Production and Construction Group, Urumqi, Xinjiang 830011)

To improve and optimize antifungal protein production by a newly isolated B. axarquiensis, Plackett-Burman (PB) design and Box-Behnken design (BB) were adopted in culture conditions, the PB design was undertaken to evaluate the effects and Box-Behnken design was used to optimize the critical internal factors.The results showed that, the peptone, glucose and pH were the key factors, the optical concentration of the variables were determined as glucose at 2.53%, peptone at 1.76% and pH at 7.17. Protein yield increased by 34.55% compared with before optimization.

B. axarquiensis TUBP1; response surface method; antifungal protein; fermentation conditions

2015-06-18

國家自然科學(xué)基金(31260013)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)博士基金(2013BB006)；塔里木大學(xué)校長博士基金(TDZKBS201206)。

馬江鋒(1982-)，男，研究方向?yàn)橹参锉Ｗo(hù)。E-mail：30768050@qq.com

*為通訊作者E-mail：zenghong0705@163.com

1009-0568(2016)01-0005-09

TQ92

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2016.01.002