表沒食子兒茶素沒食子酸酯對脂多糖誘導膠質細胞炎癥的保護作用

陳　華　苗加偉　李　晶　郝　坡

(重慶三峽醫藥高等專科學校，重慶　404120)

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表沒食子兒茶素沒食子酸酯對脂多糖誘導膠質細胞炎癥的保護作用

陳華苗加偉李晶1郝坡

(重慶三峽醫藥高等專科學校，重慶404120)

目的觀察表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對細菌脂多糖(LPS) 所致大鼠神經膠質細胞炎癥的保護作用。方法取新生乳鼠原代神經膠質細胞培養，利用LPS激活小膠質細胞引起炎癥反應。熒光探針檢測細胞內超氧化自由基的水平；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和Western 印跡檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-8、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、炎性因子蛋白含量的變化。結果LPS激活神經小膠質細胞，促進其釋放超氧化自由基，誘導炎癥因子的過度表達，大幅上調TNF-α、IL-1β、IL-8炎性因子和升高iNOS蛋白質水平(P<0.05)，EGCG明顯抑制超氧化自由基及上述炎癥因子的過度產生，減輕LPS對神經膠質細胞的毒性。結論EGCG能減弱LPS引起的體外培養神經膠質細胞的炎癥反應。

EGCG；脂多糖；炎癥；神經保護

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)具有預防和治療心腦血管系統疾病、保護神經系統等多種藥理作用〔1,2〕。近年研究證實EGCG具有一定抗炎活性〔3～7〕。目前，EGCG對原代培養的腦膠質細胞抗炎作用產生保護尚未見報道。本實驗利用細菌脂多糖(LPS)引起大鼠神經膠質細胞急性炎癥模型，觀察EGCG對神經系統炎癥的作用和機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物出生1～2 d的SD乳鼠，重慶醫科大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證號:SYXK(渝) 20022007。

1.2藥品及試劑EGCG購自重慶市卓諾生物技術有限公司；血清、LPS、氨基酸對照品及超氧化自由基檢測試劑盒購于美國Sigma公司；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自美國R&D公司；所有一抗和二抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3儀器設備二氧化碳注入式電熱恒溫培養箱(美國Thermo Electron 公司)；超凈工作臺(蘇州精華設備公司)；倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；96孔板清洗儀、酶標儀。

1.4方法

1.4.1大鼠原代膠質細胞培養取新生SD小鼠，75%乙醇皮膚消毒5 min后斷頭，眼科剪開顱取腦，游離兩側大腦皮質置于D-Hank溶液浸潤，用鑷子剝離腦膜和血管，0.25%胰酶消化制成懸液。懸液過200目鋼網后1 500 r/min離心3 min，分離后添加DMEM培養基加滅活后微孔濾膜過濾10%胎牛血清培養液，吸取細胞液接種24孔板，滴加青霉素/鏈霉素(100 U/L)，調整細胞密度約為1×105/孔。培養皿放入5%CO2恒溫培養箱，37℃培養48 h后換液清洗一次，持續培養7～10 d至細胞長滿融合備用。

1.4.2分組及加藥處理實驗分為：①空白對照組；②LPS(10 μg/L)組；③20 μmol/L EGCG；④40 μmol/L EGCG；⑤80 μmol/L EGCG。 每組6孔，實驗重復 5 次。空白對照組細胞每孔分別加入等量DMEM基礎培養基，其他組膠質細胞培養皿中預先加入EGCG溶液作用24 h，再加入LPS作用2 h。前期細胞培養證實二甲基亞砜(DMSO)濃度<0.05%對膠質細胞無明顯毒性反應，藥物EGCG采用DMSO溶解，所得混懸液再用DMEM培養液稀釋，配置成EGCG標準液。

1.4.3MTT比色法檢測細胞活力及胞內超氧化自由基的測定膠質細胞以1×105/孔的密度接種96孔板，加入MTT染色劑噻唑藍(6 mg/ml)孵育4 h，滴加DMSO，震蕩后用全自動酶標儀測定570 nm處OD值并減去空白OD值；此外，用485、530 nm雙波長激發，按試劑盒的說明利用二氯熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA) 作為熒光探針檢測細胞內超氧化自由基的含量。

1.4.4炎性因子測定經過EGCG處理的細胞，收取細胞培養上清液，根據ELISA試劑盒的說明測定細胞培養液中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β和IL-8含量變化。裂解液處理加藥膠質細胞，15 000 r/min離心20 min，取上清，BCA法蛋白定量，Western印跡測定誘導型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表達情況。β-actin作為內參對照，比較不同組細胞蛋白表達差異。

1.5統計學方法采用SPSS17.0 軟件進行單因素方差分析。

2　結　果

2.1EGCG細胞對MTT及超氧化自由基的影響與空白對照組比較，在LPS處理的膠質細胞培養模型中，超氧化自由基的產量顯著增加(240%)，OD值明顯降低(63%)。與LPS組比較，預先用EGCG(20、40、80 μmol/L) 處理的細胞中超氧化自由基的產量明顯降低，抑制率分別為26%、33%和37%。EGCG處理組OD值與劑量呈正相關，以空白對照組OD值為參照，分別為68.5%、75.3%和88.9%(均P<0.05)，細胞存活率顯著提高。

2.2不同劑量EGCG對膠質細胞炎癥因子水平的影響LPS明顯刺激TNFα、IL-1β、IL8大量釋放；與LPS組比較，不同濃度EGCG均能明顯減少上清液中炎癥因子的含量，且這一抑制作用與EGCG濃度呈正相關。見表1。

2.3Western 印跡分析結果與空白對照組比較，LPS誘導iNOS蛋白表達明顯增加；與LPS組比較，不同濃度的EGCG均能夠抑制iNOS的蛋白表達。見圖1。

表1　EGCG對細胞培養上清液中炎癥因子水平的影響

與空白對照組比較：1)P<0.05，與LPS組比較：2)P<0.05

A.空白對照組；B.LPS組；C.20 μmol/L EGCG組；D.40 μmol/L EGCG組；E.80 μmol/L EGCG組圖1　EGCG對細胞內iNOS蛋白表達水平的影響

3　討　論

神經膠質細胞和神經元的關系密切，神經膠質細胞的炎癥反應與神經元凋亡具有很強的相關性。許多神經退行性疾病中都顯示出神經膠質細胞的活化以及神經膠質細胞介導的炎癥反應導致神經元細胞凋亡和死亡。LPS誘導神經膠質細胞，模擬在人體內發生的上述炎性反應變化，誘發神經元的凋亡，此作用類似于慢性神經系統損傷中引起神經元死亡的過程。本實驗應用LPS引起大鼠神經膠質細胞炎癥模型，驗證了EGCG的抗炎作用。EGCG能明顯抑制細菌LPS誘導的炎癥因子如TNF-α、IL-8、IL-1β和iNOS的過度表達，從而減輕炎癥因子的毒性作用。EGCG通過多靶點機制〔8,9〕對中樞神經系統退行性疾病具有防治作用〔10〕，本實驗結果進一步證實它是茶多酚抗炎作用的有效成分之一，這也進一步證實了其他學者對EGCG體外抗炎作用的研究〔11,12〕。

TNF-α是創傷或感染等病理條件下最早產生的功能細胞因子之一，它可刺激IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥介質，并能協同擴大其生物學效應。增高的IL-1β參與腦水腫的形成，血腦屏障的破壞并進一步誘導其他炎性介質造成神經細胞的毒性，導致細胞腫脹和死亡，EGCG可以減輕損傷增加細胞存活率，這一結果與國外研究一致〔13〕。LPS模擬病理過程下激活一氧化氮合酶(NOS)mRNA表達增加，誘導iNOS水平及活性明顯增高，促進一氧化氮(NO)合成，血管內皮通透性增加，炎性加重，而EGCG通過抑制iNOS活化，減輕了炎性損傷程度。

綜上所述，EGCG是茶多酚發揮抗炎作用的有效成分之一，具有抑制炎癥因子的過度表達，減輕LPS引發腦內炎癥反應的作用。本研究結果增加了EGCG對抗炎的認識，拓寬了人們對EGCG用于心腦血管保護藥理作用機制的理解〔14,15〕。

1Singh BN,Shankar S,Srivastava RK.Green tea catechin,epigallocatechin-3-gallate(EGCG):mechanisms,perspectives and clinical applications〔J〕.Biochem Pharmacol，2011；82(12):1807-21.

2Singh R,Akhtar N,Haqqi TM.Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate:inflammation and arthritis〔J〕.Life Sci，2010；86(25-26):907-18.

3張惠燕，王劍勇，姚航平.表沒食子兒茶素沒食子酸酯抑制脂多糖誘導人視網膜內皮細胞中調節活化正常T細胞表達與分泌趨化因子的表達 〔J〕.生理學報,2014；66(2):145-50.

4杜玉,婁紅祥.表沒食子兒茶素沒食子酸酯藥理作用研究進展〔J〕.國外醫藥(植物藥冊)，2006；21(6):244-9.

5鄧鳳君，楊迎暴，徐江平，等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯對脊髓損傷大鼠炎癥因子釋放及神經營養因子表達的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志,2010；16(7):195-8.

6Bae HB,Li M,Kim JP,etal.The effect of epigallocatechin gallate on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in a murine model〔J〕.Inflammation，2010；33(2):82-91.

7Joo SY,Song YA,Park YL,etal.Epigallocatechin-3-gallate inhibits LPS-induced NF-κB and MAPK signaling pathways in bone marrow-derived macrophages〔J〕.Gut Liver,2012；6(2):188-96.

8Chen D,Milacic V,Chen MS,etal.Tea polyphenols,their biological effects and potential molecular targets〔J〕.Histol Histopathol，2008；23(4):487-96.

9Pae M,Wu D.Immunomodulating effects of epigallocate-chin-3-gallate from green tea:mechanisms and applications〔J〕.Food Funct，2013；4(9):1287-303.

10Hǜgel HM,Jackson N.Redox chemistry of green tea polyphenols:therapeutic benefits in neurodegenerative diseases〔J〕.Mini Rev Med Chem,2012；12(5):380-7.

11El-Mowafy AM,Al-Gayyar MM,Salem HA,etal.Novel chemotherapeutic and renal protective effects for the green tea (EGCG):role of oxidative stress and inflammatory-cytokine signaling〔J〕.Phytomedicine,2010;17(14):1067-75.

12張東芳，肖鵬，韓晨露，等.表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯抑制脂多糖誘導的巨噬細胞促炎因子TNF-α和IL-1β基因表達〔J〕.中國生物化學與分子生物學報,2014；30(4)：402-8.

13Itoh T,Imano M,Nishida S,etal.Epigallocatechin-3-gallate increases the number of neural stem cells around the damaged area after rat traumatic brain injury〔J〕.J Neural Transm,2012,119(8):877-90.

14Andrade JP,Assunc?o M.Protective effects of chronic green tea consumption on age-related neurodegeneration〔J〕.Curr Pharm Des,2012；18(1):4-14.

15葛建，林芳，李明揆，等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)生物活性研究進展〔J〕.安徽農業大學學報,2011；38(2):156-63.

〔2015-02-16修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

重慶市基礎與前沿研究計劃項目(cstc2014jcyjA10049)；重慶市高等學校青年骨干教師資助計劃(2014年)

郝坡(1980-)，男，碩士，副教授，主要從事生物化學與分子生物學研究。

陳華(1965-)，男，副教授，主要從事生物化學與分子生物學研究。

R285

A

1005-9202(2016)16-3913-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.019

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